Amplificación de polimerasa recombinase
Amplificación de polimerasa recombinase (RPA) es un solo tubo isotermo alternativa a la Reacción en cadena de polimerasa (PCR).[1] Mediante la adición de un de la transcriptasa reversa enzima a una reacción de RPA puede detectar RNA así como DNA, sin necesidad de un paso separado producir cDNA,.[2][3][4] Porque es isotérmica, Reacciones de RPA necesitan mucho equipo más simple de PCR, que necesita un termociclador. Funcionamiento mejor en temperaturas de 37-42 ° C y sigue trabajando, aunque más lentamente, a temperatura ambiente significa RPA reacciones en teoría se pueden ejecutar rápidamente simplemente sosteniendo un tubo. Esto hace RPA un candidato excelente para el desarrollo de pruebas moleculares de bajo costo, rápidas, punto de atención. Una reciente evaluación de la calidad internacional de detección molecular de Virus de la fiebre del valle del Rift realizado así como de las mejores pruebas RT-PCR, detectar muestras menos concentradas por algunas pruebas PCR y una prueba RT_LAMP.[5] RPA fue desarrollado y lanzado por TwistDx Ltd. (anteriormente conocido como ASM Scientific Ltd), una biotecnología compañía con sede en Cambridge, Reino Unido.
Técnica
El proceso EPR emplea tres enzimas – un recombinase, un proteína de unión a ADN monocatenario (SSB) y desplace el filamento de la polimerasa. Recombinasas son capaces de emparejar oligonucleótidos cartillas con secuencia homóloga en el ADN dúplex.[1] SSB se unen a desplazados hebras de ADN y evitar la cartillas de de ser desplazados. Por último, la cadena desplazando polimerasa comienza Síntesis de ADN que ha enlazado la cartilla con el ADN diana. Mediante el uso de dos bases opuestas, como PCR, si la secuencia de destino es hecho presente, una exponencial Amplificación del ADN se inicia la reacción. No hay ninguna otra manipulación de la muestra tales como fusión térmica o química es necesaria para iniciar la amplificación. En temperaturas óptimas (37-42 ° C), la reacción progresa rápidamente y los resultados de ADN amplificación específica de pocos ejemplares de destino a niveles detectables, normalmente dentro de 5-10 minutos,[2][3][4][6][7][8]
Las enzimas RPA de tres pueden ser suplidas por otras enzimas para proporcionar funcionalidad adicional. Además de la exonucleasa III permite el uso de una sonda de exo para detección de fluorescencia en tiempo real, similar a la PCR en tiempo real.[1] Además de la endonucleasa IV significa que se puede utilizar una sonda de nfo para detección de tira de flujo lateral de amplificación exitosa.[1][6][9] Si se agrega una transcriptasa inversa que funciona a 37-42 ° C puede ser RNA revés transcrito y el cDNA producido amplifican todo en un solo paso. Actualmente solamente la versión de exo TwistAmp de RPA está disponible con la transcriptasa reversa incluida, aunque los usuarios pueden simplemente complementar otras reacciones TwistAmp con una transcriptasa inversa para producir el mismo efecto. Como con PCR, pueden ser todas las formas de reacciones de RPA multiplexados por la adición de más pares de primer punta de prueba, permitiendo la detección de múltiples analitos o control interno en el tubo mismo.
Relación a otras técnicas de amplificación
RPA es una de varias técnicas de amplificación de ácido nucleico isotermo para ser desarrollada como una técnica de diagnóstico molecular, con frecuencia con el objetivo de simplificar la instrumentación de laboratorio necesaria relativa a POLIMERIZACIÓN EN CADENA. Incluye una lista parcial de otras técnicas de amplificación isotérmica LÁMPARA, NASBA, Amplificación helicase-dependiente (HDA), y Mellar la reacción de amplificación enzimática (CERCA). Las técnicas difieren en los detalles del mecanismo de reacción y diseño de cartilla y en algunos casos (como RPA) hacen uso de cócteles de dos o más enzimas. Como RPA, muchas de estas técnicas ofrecen tiempos de amplificación rápida con el potencial para instrumentación simplificada y reportada resistencia a las sustancias en las muestras no purificadas que se saben que inhiben la PCR. Con respecto al tiempo de amplificación, debe señalarse que modernos termocicladores con rampas de temperatura rápida pueden reducir los tiempos de amplificación PCR a menos de 30 minutos, particularmente para amplicones corto con doble temperatura ciclismo en lugar de los protocolos convencionales de tres temperaturas.[10] Además, las exigencias de la preparación de la muestra (incluyendo lisis y extracción de ADN o ARN, si es necesario) puede considerarse parte de la global y la complejidad inherentes a la técnica. Estos requisitos varían según la técnica, así como a los específicos y tipo de muestra.
Comparado con PCR, las directrices para el diseño de la cartilla y sonda para RPA están menos establecidas y pueden tomar un cierto grado de ensayo y error. El principio general de un amplicón discreta delimitada por un primer avance y retroceso con una sonda (opcional) fluorógenos interna es similar a PCR. Cebadores PCR pueden utilizarse directamente en RPA, pero su longitud corta significa que la recombinación tarifas y RPA no será especialmente sensible o rápido. Normalmente iniciadores base 30-38 son necesarios para eficiente recombinase filamento formación y rendimiento del RPA. Esto está en contraste con algunas otras técnicas como la lámpara que utilizan un mayor número de cartillas sujeta a limitaciones de diseño adicional. Aunque el informe de 2006 original de RPA describe un conjunto funcional de componentes de la reacción, la formulación actual (propietaria) del kit TwistAmp es "sustancialmente diferente" [11] y está disponible en un único proveedor. Esto es en comparación con mezclas de reacción para POLIMERIZACIÓN EN CADENA que están disponibles de muchos proveedores, o LÁMPARA o NASBA para que la composición de la mezcla de reacción se publica libremente, permitiendo a los investigadores a crear sus propio personalizados "kits" de ingredientes baratos.
Literatura científica publicada generalmente carece de comparación detallada de la realización de técnicas de amplificación isotérmica como RPA, HDA y lámpara en relación con otras, a menudo algo comparando una sola técnica isotérmica para un ensayo PCR "estándar de oro". Esto hace difícil juzgar los méritos de estas técnicas independientemente de las pretensiones de los fabricantes, inventores o autores. Además, características de rendimiento de cualquier técnica de amplificación son difíciles de separar del primer diseño: una cartilla "buena" para un destino para RPA puede dar mayor amplificación o detección más sensible que una cartilla de lámpara "pobre" para el mismo objetivo, pero lo contrario puede ser cierto para conjuntos de cartilla diferente para un objetivo diferente. Como PCR y cualquier otra técnica de amplificación, obviamente existe un sesgo de publicación, con bajo rendimiento sistemas cartilla raramente considerados dignos de reporting, pero esos artículos que se publican muestran lo que es posible.
Referencias
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