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Síntesis de oligonucleótidos

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Síntesis de oligonucleótidos es la síntesis química de fragmentos relativamente cortos de ácidos nucleicos con estructura química definida (secuencia de). La técnica es extremadamente útil en la actual práctica de laboratorio ya que proporciona un acceso rápido y barato a medida oligonucleótidos de la secuencia deseada. Considerando que la enzimas sintetizar DNA y RNA sólo en un 5' a 3' dirección, síntesis química de oligonucleótidos no sufren esta limitación, aunque más a menudo, es, realizado en el opuesto, 3' hacia 5'. Actualmente, el proceso se implementa como síntesis en fase sólida utilizando phosphoramidite método y a phosphoramidite bloques derivados protegido 2'-deoxynucleosides (dA, dC, dG, y T), ribonucleosides (A, C, G, y U), o modificados químicamente de nucleósidos, por ejemplo LNA, BNA.

Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques se acoplan secuencialmente a la creciente cadena de oligonucleótidos en el orden requerido por la secuencia del producto (véase Ciclo sintético a continuación). El proceso ha sido automatizado completamente desde finales de los setenta. Al finalizar el montaje de la cadena, el producto es liberado de la fase sólida a la solución deprotected y recogido. La aparición de reacciones secundarias establece límites prácticos para la longitud de los oligonucleótidos sintéticos (hasta unos 200 nucleótido residuos) debido a la cantidad de errores se acumula con la longitud de los oligonucleótidos se sintetizan.[1] Los productos son a menudo aislados por cromatografía líquida de alta (HPLC) para obtener los deseado oligonucleótidos de alta pureza. Típicamente, oligonucleótidos sintéticos son moléculas de ADN o ARN monocatenario alrededor de 15 – 25 bases de longitud.

Oligonucleótidos encuentran una gran variedad de aplicaciones en biología molecular y medicina. Comúnmente se utilizan como antisentido oligonucleótidos, ARN interferente pequeño, cartillas de para Secuencia de la DNA y amplificación de, puntas de prueba para la detección de DNA o el RNA complementario vía molecular hibridación, herramientas para la introducción específica de mutaciones y sitios de restriccióny para la síntesis de genes artificiales.

Contenido

  • 1 Historia
    • 1.1 Primeros trabajos y síntesis contemporánea de H-fosfonato
    • 1.2 Síntesis del fosfodiéster
    • 1.3 Síntesis de Phosphotriester
    • 1.4 Síntesis de triester de fosfito
  • 2 Síntesis por el método phosphoramidite
    • 2.1 Bloques de construcción
      • 2.1.1 Phosphoramidites de nucleósidos
      • 2.1.2 Phosphoramidites no-nucleósido
    • 2.2 Ciclo sintético
      • 2.2.1 Paso 1: Desbloqueo (detritylation)
      • 2.2.2 Paso 2: acoplamiento
      • 2.2.3 Paso 3: tapado
      • 2.2.4 Paso 4: oxidación
    • 2.3 Soportes sólidos
      • 2.3.1 Material de soporte sólido
      • 2.3.2 Química de vinculador
    • 2.4 OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos y sus síntesis
    • 2.5 Automatización
    • 2.6 Síntesis de oligonucleótidos mediados a gran escala - una historia
    • 2.7 Síntesis de los microarrays de oligonucleótidos
  • 3 Procesamiento post-sintético
  • 4 Caracterización
  • 5 Véase también
  • 6 Referencias
  • 7 Enlaces externos
  • 8 Lectura adicional

Historia

La evolución de la síntesis de oligonucleótidos vio cuatro métodos principales de la formación de enlaces internucleosidic y ha sido revisada en la literatura en gran detalle.[2][3][4]

Primeros trabajos y síntesis contemporánea de H-fosfonato

Esquema. 1. i: N-Bromosuccinimida; BN = -CH 2Ph

En los primeros años cincuenta, Alexander Todddel grupo pionero de H-fosfonato y fosfato de Triester métodos de síntesis de oligonucleótidos.[5][6] La reacción de compuestos 1 y 2 para formar H-fosfonato diéster 3 es un H-fosfonato de acoplamiento en la solución mientras que el de los compuestos 4 y 5 Dar 6 es un phosphotriester de acoplamiento (véase síntesis del phosphotriester más abajo).

Esquema 2. Síntesis de oligonucleótidos por el método de H-fosfonato

Treinta años más tarde, este trabajo inspirado, independientemente, dos grupos para adoptar la química de H-fosfonato a la síntesis en fase sólida usando Monoésteres de H-fosfonato nucleósido de investigación 7 como bloques de construcción y pivaloyl cloruro, cloruro de 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl (TPS-Cl) y otros compuestos como activadores.[7][8] La aplicación práctica del método de H-fosfonato resultó en un ciclo sintético muy corto y simple que consiste en sólo dos pasos, detritylation y acoplamiento (esquema 2). Oxidación de internucleosidic H-fosfonato diéster en 8 a enlaces fosfodiéster en 9 con una solución de yodo en medio acuoso piridina se lleva a cabo al final de la Asamblea de la cadena en lugar de como un paso en el ciclo sintético. Si lo desea, la oxidación puede llevarse a cabo bajo condiciones anhidras.[9] Por otra parte, 8 se puede convertir en fosfotioato 10[10][11][12][13] o phosphoroselenoate 11 (X = Se),[14] u oxidadas por CCl4 en presencia de aminas primarias o secundarias a análogos de la phosphoramidate 12.[15][16] El método es muy conveniente que varios tipos de modificaciones de fosfato (fosfato/fosfotioato/phosphoramidate) pueden introducirse en el mismo oligonucleótido para la modulación de sus propiedades.[17][18][19]

Más a menudo, bloques de H-fosfonato están protegidos en el Grupo 5'-hidroxilo y el grupo amino de nucleicos bases A, C y G de la misma manera como bloques de construcción phosphoramidite (véase abajo). Sin embargo, la protección en el grupo amino no es obligatoria.[9][20]

Síntesis del fosfodiéster

Esquema. 3 acoplamiento de oligonucleótidos por el método del fosfodiéster; TR = - CPh 3

En la década de 1950, Har Gobind Khorana y sus colaboradores desarrolladas una enlaces fosfodiéster método donde 3'-O-acetylnucleoside-5'-O-fosfato de 2 (Esquema 3) fue activado con N,N‍ '​-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o cloruro de 4-toluenesulfonyl (Ts-Cl). La especie activada fueron reaccionada con un 5'-O-protegido de nucleósidos 1 para dar un monofosfato de Dinucleósido protegido 3.[21] Sobre el retiro de 3'-O-Grupo acetilo mediante hidrólisis catalizada por base, mayor elongación de la cadena se llevó a cabo. Siguiendo esta metodología, sistemas de tri - y tetradeoxyribonucleotides se sintetizaron y se convierte enzimáticamente a oligonucleótidos más largo, que permitió la aclaración de la código genético. La limitación principal del método del fosfodiéster consistía en la formación de oligómeros de pirofosfato y oligonucleótidos ramificaron en el fosfato internucleosidic. El método parece ser un paso detrás de la química más selectiva descrita anteriormente; sin embargo, en aquel momento, grupos fosfato-protección más disponibles ahora tenían todavía no ha introducido. La falta de la estrategia de protección conveniente requería tomar un retiro a una química más lenta y menos selectiva para lograr el objetivo final del estudio.[2]

Síntesis de Phosphotriester

Esquema 4. Oligonucleótidos de acoplamiento por método de phosphotriester; TMM = - CPh 2(4-MeOC 6H 4).

En la década de 1960, grupos dirigidos por R. Letsinger[22] y C. Reese[23] desarrollado un enfoque phosphotriester. La diferencia definitoria del enfoque fosfodiéster era la protección de la molécula de fosfato en el bloque de construcción 1 (Esquema 4) y en el producto 3 con 2-cyanoethyl Grupo. Esto impidió la formación de oligonucleótidos ramificados en el fosfato internucleosidic. La mayor selectividad del método permitió el uso de agentes de acoplamiento y catalizadores más eficientes[24][25] que redujo drásticamente la longitud de la síntesis. El método, inicialmente desarrollado para la síntesis de la fase de solución, se implementó también en poliestireno de bajo-cruz-ligado "palomitas",[26] y vidrio de poro controlado posteriormente (CPG, ver "Sólido" material de apoyo debajo), que inició un esfuerzo de investigación masiva en fase sólida síntesis de oligonucleótidos y llevó finalmente a la automatización de la Asamblea de cadena de oligonucleótidos.

Síntesis de triester de fosfito

En la década de 1970, substancialmente más reactiva P(III) derivados de nucleósidos, 3'-O-chlorophosphites, fueron utilizados con éxito para la formación de enlaces internucleosidic.[27] Esto condujo al descubrimiento de la triester de fosfito metodología. El grupo liderado por M. Caruthers aprovechó el menos agresivo y más selectivo 1H-tetrazolidophosphites y el método en fase sólida.[28] Muy poco después, los trabajadores del mismo grupo mejoraron el método mediante el uso de phosphoramidites de nucleósidos más estable como bloques de construcción.[29] El uso de 2-cyanoethyl grupo fosfito-protección[30] en lugar de un uso menos fácil metilo Grupo[31][32] condujo a la phosphoramidites de nucleósidos actualmente usado en la síntesis del oligonucleótido (ver Phosphoramidite bloques más abajo). Muchas mejoras posteriores a la fabricación de bloques de construcción, sintetizadores de oligonucleótidos y protocolos sintéticos hacen muy confiable la química phosphoramidite y acelerar el método de elección para la preparación de oligonucleótidos sintéticos.[1]

Síntesis por el método phosphoramidite

Bloques de construcción

Phosphoramidites de nucleósidos

Artículo principal: Análogos de los nucleósidos phosphoramidite
Protegido deoxynucleoside 2' phosphoramidites.

Como se mencionó anteriormente, los nucleótidos de origen natural (nucleósido-3'- o 5'-fosfato) y sus análogos fosfodiéster son suficientemente reactivos para permitir una preparación sintética de acelere de oligonucleótidos en altos rendimientos. La selectividad y el ritmo de la formación de enlaces internucleosidic es mejorado considerablemente mediante el uso de 3'-O-(N,N-diisopropyl phosphoramidite) derivados de nucleósidos (nucleósido phosphoramidites) que sirven como bloques de construcción en la metodología de triester de fosfito. Para evitar reacciones secundarias no deseadas, todos los demás grupos funcionales presentes en nucleósidos tienen que ser prestados unreactive (protegido) uniendo protección de los grupos. Al finalizar el montaje de la cadena de oligonucleótidos, todos los grupos de protección se eliminan para producir las deseada oligonucleótidos. A continuación, los grupos de protección actualmente utilizados en comercios[33][34][35][36] y se repasan brevemente la bloques de phosphoramidite nucleósidos más comunes:

  • El Grupo 5'-hidroxilo está protegido por un ácido lábil DMT (4, 4'-dimethoxytrityl) grupo.
  • Timina y uracilo, nucleicos bases de timidina y Uridina, respectivamente, no tienen grupos amino exocyclic y por lo tanto, no requieren ningún tipo de protección.
  • Aunque la base de la guanosina y 2'-desoxiguanosina nucleico tienen un grupo amino exocyclic, su basicidad es de baja a un grado que no reacciona con phosphoramidites en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Sin embargo, deriva un phosphoramidite desprotegido N2 5'-O-DMT-2'-desoxiguanosina es pobremente soluble en acetonitrilo, el solvente utilizado en la síntesis de oligonucleótidos.[37] En cambio, las versiones protegidas de N2 del mismo compuesto se disuelven bien en acetonitrilo y por lo tanto son ampliamente utilizadas. Nucleicos bases adenina y citosina tener los grupos aminoácidos exocyclic reactivos con el phosphoramidites activado en las condiciones de la reacción de acoplamiento. Por el uso de medidas adicionales en el ciclo sintético[38][39] o alternativa sistemas de solventes y agentes de acoplamiento[37] el montaje de la cadena de oligonucleótidos puede llevarse a cabo con phosphoramidites dA y dC de grupos amino desprotegidos. Sin embargo, estos enfoques siguen siendo actualmente en la etapa de investigación. En la síntesis de oligonucleótidos rutina exocyclic grupos amino en nucleósidos se mantienen permanentemente protegidos sobre la longitud entera de la Asamblea de cadena de oligonucleótidos.

La protección de los grupos aminoácidos exocyclic ha de ser ortogonal para el Grupo 5'-hidroxilo porque este último se retira al final de cada ciclo sintético. El más simple de implementar y por lo tanto, el más ampliamente aceptado es la estrategia donde los grupos aminoácidos exocyclic llevan una protección de base inestable. Más a menudo, se utilizan dos sistemas de protección.

  • En el primero, el esquema estándar y más robusto (figura), Bz protección (benzoilo) se utiliza para A, dA, C y CC, mientras que G y dG son protegidos con grupo de isobutyryl. Más recientemente, Ac Grupo (acetil) se utiliza a menudo para proteger C y dC como se muestra en la figura.[40]
  • En el esquema de protección suave, segundo, A y dA están protegidos con isobutyryl[41] o grupos de phenoxyacetyl (PAC).[42] C y dC llevan protección de acetilo,[40] G y dG son protegidos con (4-isopropylphenoxyacetyliPr-PAC)[43] o dimethylformamidino (dmf)[44] grupos. Grupos protección suaves se eliminan más fácilmente que el estándar de protección de los grupos. Sin embargo, los phosphoramidites teniendo estos grupos son menos estables cuando se almacenan en la solución.
  • El grupo fosfito está protegido por una base inestable 2-cyanoethyl Grupo.[30] Una vez un phosphoramidite se han unido al oligonucleótido enlazado a soporte sólido y las moléculas de fosfito se han convertido en la especie P(V), la presencia de la protección del fosfato no es obligatoria para la realización exitosa de más reacciones de acoplamiento.[45]
2'- O-protegido de ribonucleósido phosphoramidites.
  • En la síntesis de RNA, el grupo 2'-hidroxilo se protege con TBDMS (t-butildimetilsililo) grupo.[46][47][48][49] o con TOM (tri-ISO-propylsilyloxymethyl), grupo de[50][51] ambos son desmontables mediante tratamiento con iones de flúor.
  • La molécula de fosfito también lleva una () diisopropylaminoiPr2N) grupo reactivo bajo condiciones ácidas. Tras la activación, el grupo diisopropylamino va a ser sustituido por el Grupo 5'-hidroxilo de los oligonucleótidos de apoyo-limite (consulte "Paso 2: acoplamiento" abajo).

Phosphoramidites no-nucleósido

Phosphoramidites no-nucleósido 5'-modificación de oligonucleótidos sintéticos. TMM = mono-methoxytrityl,(4-methoxyphenyl) Difenilmetilo.

Phosphoramidites no análogos de los nucleósidos son los reactivos phosphoramidite diseñados para introducir diversas funcionalidades en el termini de oligonucleótidos sintéticos o entre residuos de nucleótidos en el medio de la secuencia. Para introducirse dentro de la secuencia, un modificador no nucleosídicos tiene que poseer al menos dos grupos hidroxilo, uno de los cuales está protegido a menudo con el grupo DMT mientras el otro lleva la molécula reactiva phosphoramidite.

Phosphoramidites no-nucleosídicos se utilizan para introducir a grupos deseados que no están disponibles en nucleósidos naturales o que pueden introducirse más fácilmente utilizando diseños químicos más simples. Una muy breve selección de reactivos comerciales phosphoramidite se muestra en el esquema para la demostración de la diversidad estructural y funcional disponible. Estos reactivos sirven para la fijación de fosfato terminal 5' (1),[52] NH2 (2),[53] SH ()3),[54] () aldehydo4),[55] y (grupos carboxílicos5),[56] (Enlaces triples) CC6),[57] las etiquetas no radiactivo y extintores (ejemplificado por 6-FAM amidite 7[58] para la fijación de con fluoresceína y dabcyl amidite 8,[59] modificadores respectivamente), hidrofílicos e hidrofóbicos (ejemplificados por hexaethyleneglycol amidite 9[60][61] y colesterol amidite 10,[62] respectivamente), y biotina amidite 11.[63]

Ciclo sintético

Esquema 5. Ciclo sintético para la preparación de oligonucleótidos por el método phosphoramidite.

Síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo por una incorporación gradual de los residuos de nucleótidos 5'-terminal de la cadena creciente hasta que se monta la secuencia deseada. Cada adición se conoce como un ciclo sintético (esquema 5) y consta de cuatro reacciones químicas:

Paso 1: Desbloqueo (detritylation)

El grupo DMT se extrae con una solución de un ácido, como el 2% ácido tricloroacético (TCA) o el 3% ácido dicloroacético (DCA), en una (solvente inertediclorometano o tolueno). El catión DMT de color naranja formado se lava los resultados del paso en el precursor de oligonucleótidos enlazado a soporte sólido con un grupo hidroxilo 5'-terminal libre. Vale la pena recordar que la conducción de detritylation durante un tiempo prolongado o con más soluciones de ácidos conduce a depurinación de sólido apoyo-limite oligonucleótidos y por lo tanto reduce el rendimiento del producto deseado de larga duración.

Paso 2: acoplamiento

Un 0.02-0.2 M solución de phosphoramidite nucleósido (o una mezcla de varios phosphoramidites) en acetonitrilo es activado por un 0,2 – 0,7 M solución de un ácido azole catalizador, 1H-tetrazol, 2-ethylthiotetrazole,[64] 2-benzylthiotetrazole,[65][66] 4,5-dicyanoimidazol,[67] o un número de compuestos similares. Una información más amplia sobre el uso de varios agentes de acoplamiento en la síntesis del oligonucleótido puede encontrarse en una revisión reciente.[68] La mezcla es generalmente muy breve y se presenta en líneas fluidas de sintetizadores de oligonucleótidos (véase abajo) mientras que los componentes están siendo entregados a los reactores que contienen soporte sólido. El phosphoramidite activado en 1.5 – solucíon exceso sobre el material de apoyo-limite entonces es traído en contacto con el soporte sólido inicial (primer acoplamiento) o un precursor de apoyo-limite de oligonucleótidos (acoplamientos siguientes) cuyo grupo 5'-hidroxilo reacciona con la molécula phosphoramidite activado de la entrante phosphoramidite nucleósidos para formar un vínculo de triester de fosfito. El acoplamiento de deoxynucleoside 2' phosphoramidites es muy rápido y requiere, en pequeña escala, unos 20 s para su terminación. En contraste, sterically obstaculizado 2'-O-phosphoramidites de ribonucleósido protegida requiere 5-15 minutos para acoplarse en altos rendimientos.[47][69][70][71] La reacción también es muy sensible a la presencia de agua, especialmente cuando se utilizan soluciones diluidas de phosphoramidites y comúnmente se lleva a cabo en acetonitrilo anhidro. Generalmente, cuanto mayor sea la escala de la síntesis, menor el exceso y la más alta es la concentración de la phosphoramidites utilizado. En contraste, la concentración del activador es determinada principalmente por su solubilidad en acetonitrilo y es independientemente de la escala de la síntesis. Sobre la terminación del acoplamiento, los reactivos y subproductos son eliminados mediante lavado.

Paso 3: tapado

El paso tapado se realiza tratando el material sólido de apoyo enlazados con una mezcla de anhídrido acético y 1-Metilimidazol o, con menos frecuencia, DMAP como catalizadores y, en el método phosphoramidite, sirve para dos propósitos.

  • Después de la terminación de la reacción de acoplamiento, un pequeño porcentaje de los grupos enlazados a soporte sólido 5'-OH (0.1 a 1%) sigue sin reaccionar y debe ser bloqueado permanentemente mayor elongación de la cadena para prevenir la formación de oligonucleótidos con una canceladura baja interna comúnmente como shortmers (n-1). Los grupos 5'-hidroxilo son, en gran parte, acetilados por la mezcla que capsula.
  • También se ha divulgado que phosphoramidites activa con 1H-tetrazol reacciona, en pequeña medida, con la O6 posición de guanosina.[72] A oxidación con2 de agua, este producto de lado, posiblemente a través de O6-Migración N7, sufre depurinación. El APURINICO sitios así formados son fácilmente divididos en el curso de la desprotección final de oligonucleótidos bajo condiciones básicas (véase abajo) para dar dos oligonucleótidos más cortos, reduciendo así el rendimiento del producto integral. El O6 modificaciones se eliminan rápidamente por el tratamiento con el reactivo tapado mientras se realiza el paso tapado previa oxidación con2diesel.
  • La síntesis de OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos (OPS, ver más abajo) implican la oxidación con el2agua y, respectivamente, no sufren la reacción lateral descrita anteriormente. Por otro lado, si se realiza el paso tapado antes sulfurization, el apoyo sólido puede contener la izquierda N-Metilimidazol y anhídrido acético residual después del paso de tapado. La mezcla que capsula interfiere con la reacción de transferencia de azufre, que resulta en la formación amplia de los vínculos internucleosidic de triester de fosfato en lugar de la deseada triésteres de PS. Por lo tanto, para la síntesis de la OPS, es recomendable realizar el paso sulfurization previa al paso que capsula.[73]

Paso 4: oxidación

La vinculación de triester de fosfito de tricoordinated recién formado no es natural y es de estabilidad limitada en las condiciones de síntesis de oligonucleótidos. El tratamiento de los materiales de apoyo-limite con yodo y agua en presencia de una base débil (piridina, lutidina, o colidina) oxida el fosfito triester en un triester tetracoordinadas fosfato, precursor protegido de la natural vinculación internucleosidic de diester fosfato. Oxidación puede llevarse a cabo bajo condiciones anhidras utilizando terc-Butilo hidroperóxido[74] o, más eficazmente, (1S)-(+)-(10-camphorsulfonyl)-oxaziridina (CSO).[75][76][77] El paso de oxidación es sustituido con un paso sulfurization obtener OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos (véase OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos y sus síntesis a continuación). En este último caso, el paso del sulfurization mejor es realizado antes de la nivelación.

Soportes sólidos

En síntesis en fase sólida, es un oligonucleótido que forma covalente limita, a través de su grupo hidroxilo 3'-terminal, a un material de soporte sólido y permanece unido a él durante todo el curso de la Asamblea de la cadena. El soporte sólido está contenido en las columnas cuyas dimensiones dependen de la escala de síntesis y pueden variar entre 0.05mL y varios litros. La abrumadora mayoría de oligonucleótidos sintetizada en pequeña escala que van desde 40 nmol a 1 μmol. Más recientemente, la síntesis de oligonucleótidos de alto rendimiento donde se contiene el apoyo sólido en los pocillos de placas de varios pocillos (mayoría de las veces, 96 o 384 pocillos por placa) se convirtió en un método de elección para la síntesis paralela de los oligonucleótidos en pequeña escala.[78] Al final de la Asamblea de la cadena, el oligonucleótido es liberado de la ayuda sólida y es eluida de la columna o el pozo.

Material de soporte sólido

A diferencia de la síntesis orgánica en fase sólida y síntesis de péptidos, procede de la síntesis de oligonucleótidos mejor en soportes sólidos no swellable o baja swellable. Los dos materiales de uso más frecuente de fase sólida son vidrio de poro controlado (CPG) y macroporoso poliestireno (MPPS).[79]

  • GPC se define comúnmente por su tamaño de poro. En química de oligonucleótidos, poro tamaños de 500, 1000, 1500, 2000 y 3000Å se utilizan para permitir la preparación de sobre 50, 80, 100, 150 y 200-mer oligonucleótidos respectivamente. Para CPG nativo apto para su procesamiento posterior, la superficie del material se trata con (3-aminopropil) trietoxisilano darle aminopropil CPG. El brazo de aminopropil puede ser ampliado para dar lugar a larga cadena aminoalkyl (LCAA) CPG. El grupo amino se utiliza entonces como punto de anclaje para conectores adecuados para síntesis de oligonucleótidos (véase abajo).
  • MPPS adecuado para síntesis de oligonucleótidos es un low-swellable, altamente reticulado poliestireno, obtenido por la polimerización de divinilbenceno (min 60%), estirenoy 4-chloromethylstyrene en presencia de un agente porogeneous. El clorometil macroporoso que MPPS obtenida se convierte en aminomethyl MPPS.

Química de vinculador

Soportes sólidos comerciales para síntesis de oligonucleótidos.
Esquema 6. Mecanismo de 3'-desfosforilación de oligonucleótidos montado sobre soportes sólidos universales.

Para hacer el material de soporte sólido adecuado para síntesis de oligonucleótidos, enlazadores no nucleosídicos o succinates análogos de los nucleósidos se unen covalentemente a los grupos aminoácidos reactivos de aminopropil CPG CPG LCAA y aminomethyl MPPS. Los restantes grupos aminoácidos se tope con anhídrido acético. Normalmente, se utilizan tres expresiones diferentes grupos de soportes sólidos.

  • Soportes universales. En un método más reciente, más conveniente y más ampliamente utilizado, la síntesis comienza con el soporte universal donde un enlazador no nucleosídicos se adjunta al material de soporte sólido (compuestos 1 y 2). Un phosphoramidite respectivo para el residuo de 3'-terminal nucleósidos se acopla al universal soporte sólido en el primer ciclo sintético de montaje de la cadena de oligonucleótidos utilizando los protocolos estándar. El montaje de la cadena entonces se continúa hasta la terminación, después de que el oligonucleótido enlazado a soporte sólido es deprotected. La característica de los soportes sólidos universales es que la liberación de los oligonucleótidos se produce por la ruptura hidrolítica de un enlace P-O que une 3'-O de los residuos de nucleótidos 3'-terminal del vinculador universal como se muestra en el esquema 6. La ventaja fundamental de este enfoque es que el mismo soporte sólido se utiliza independientemente de la secuencia de los oligonucleótidos que se sintetizarán. Para la eliminación completa de vinculador y el fosfato 3'-terminal de los oligonucleótidos montado, el sólido apoyo 1 y varios soportes sólidos similares[80] requieren amoníaco gaseoso,[81] hidróxido de amonio acuoso, metilamina acuosa,[82] o su mezcla[83] y están comercialmente disponibles.[84][85] El soporte sólido 2[86] requiere de una solución de amoniaco en anhidro metanol y también está disponible en el mercado.[87][88]
  • Soportes sólidos nucleosídicos. En un enfoque históricamente primero y siendo popular, el grupo 3'-hidroxilo de los residuos de 3'-terminal nucleósido se une al soporte sólido mediante, más a menudo, 3'-Osuccinil - brazo como en compuesto 3. El montaje de la cadena de oligonucleótidos se inicia con el acoplamiento de un bloque de edificio phosphoramidite respectivo a la nucleótido residuo en segundo lugar de la terminal 3'. El grupo hidroxilo 3'-terminal de oligonucleótidos sintetizados en soportes sólidos nucleosídicos es deprotected condiciones algo más suaves que las que se aplican para soportes sólidos universales. Sin embargo, el hecho de que un soporte sólido nucleosídicos tiene que seleccionarse de una manera específica de secuencia reduce el rendimiento de todo el proceso de síntesis y aumenta la probabilidad de error humano.
  • Especiales soportes sólidos se utilizan para la sujeción del deseado funcionales o grupos de reportero en el terminal 3' de oligonucleótidos sintéticos. Por ejemplo, el comercial[89] soporte sólido 4[90] permite la preparación de oligonucleótidos teniendo a 3'-terminal 3-aminopropil vinculador. Semejantemente a phosphoramidites no nucleosídicos, muchos otros soportes sólidos especiales diseñados para el acoplamiento de grupos funcionales reactivos, grupos de reportero no radiactivo y modificadores terminal (c.e. colesterol u otros amarres hidrofóbicos) y adaptado para varios usos están comercialmente disponibles. Una información más detallada sobre distintos soportes sólidos para síntesis de oligonucleótidos puede encontrarse en una revisión reciente.[78]

OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos y sus síntesis

S p y R p-diastereomeric fosfotioato internucleosidic vínculos.

OLIGONUCLEOTIDOS fosforotioatos (OPS) son oligonucleótidos modificados donde uno de los átomos de oxígeno en la molécula de fosfato es reemplazado por azufre. Sólo los fosforotioatos tener azufre en una posición sin puente como se muestra en la figura se utilizan ampliamente y están disponibles comercialmente. El reemplazo del oxígeno sin puente con azufre crea un nuevo centro de Quiralidad en fósforo. En un caso simple de un dinucleótido, esto resulta en la formación de un diastereomeric par de Sp- y Rpmonophosphorothioates - Dinucleósido cuyas estructuras se muestran en la figura. En un noligonucleótidos - mer donde todos ()n– 1) internucleosidic vínculos son vínculos fosfotioato, el número de diastereoisómeros m se calcula como m = 2(n– 1). Ser análogos no naturales de los ácidos nucleicos, los OPS son substancialmente más estables hacia hidrólisis por nucleasas, la clase de enzimas destruyen los ácidos nucleicos rompiendo el puente enlace P-O de la parte de enlaces fosfodiéster. Esta propiedad determina el uso de OPS como oligonucleótidos antisentido en en vitro y en vivo aplicaciones donde es inevitable la exposición extensa a las nucleasas. Asimismo, para mejorar la estabilidad de siRNA, fosfotioato al menos un enlace a menudo se introduce en la 3'-terminal de ambos sentido y antisentido. En OPS quiralmente puras, todo-Sp diastereoisómeros son más estables a la degradación enzimática que sus análogos de todos-Rp.[91] Sin embargo, la preparación de OPS quiralmente puras sigue siendo un desafío sintético.[13][92] En la práctica de laboratorio, se utilizan mezclas de diastereoisómeros de OPS.

Síntesis de OPS es muy similar a la de los oligonucleótidos naturales. La diferencia es que el paso de oxidación es reemplazado por la reacción de transferencia de azufre (sulfurization) y que se realiza el paso tapado tras el sulfurization. Muchos reactivos reportado capaz de la transferencia de azufre eficiente, sólo tres son disponibles comercialmente:

Agentes de transferencia de azufre comercial para síntesis de oligonucleótidos.
  • (DDTT) 3-(Dimethylaminomethylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazole-3-Thione,3) proporciona rápida cinética de sulfurization y alta estabilidad en solución.[73][93][94] El reactivo está disponible de varias fuentes.[95][96]
  • 3H-1,2-benzodithiol-3-uno (), 1-dióxido4)[97][98] también conocido como reactivo de Beaucage muestra una mejor solubilidad en acetonitrilo y tiempos cortos de reacción. Sin embargo, el reactivo es de limitada estabilidad en solución y es menos eficiente en la sulfurizing vínculos de RNA.[93][94]
  • N, N, N'N'Disulfuro Tetraetiltiuramo- (TETD) es soluble en acetonitrilo y disponible comercialmente.[99] Sin embargo, la reacción del sulfurization de un acoplamiento de ADN internucleosidic con TETD requiere 15 min,[100] que es más de 10 veces tan lento que con compuestos 3 y 4.

Automatización

En el pasado, síntesis de oligonucleótidos se realizó manualmente en solución o en fase sólida. La síntesis de fase sólida se implementó utilizando como contenedores para la fase sólida, columnas de vidrio miniatura similares en su forma para columnas de cromatografía de baja presión o jeringas con filtros porosos.[101] En la actualidad, síntesis de oligonucleótidos de fase sólida se lleva a cabo automáticamente mediante instrumentos controlados por computadora (sintetizadores de oligonucleótidos) y son técnicamente implementado en columna, placa multi-bien y formatos de matriz. El formato de columna es más adecuado para la investigación y aplicaciones de gran escala donde no se requiere un alto rendimiento.[102] Formato de placa multi-bien está diseñado específicamente para el alto rendimiento síntesis a pequeña escala para satisfacer la creciente demanda de la industria y la academia de oligonucleótidos sintéticos.[103] Un número de sintetizadores de oligonucleótidos de síntesis a pequeña escala[104][105][106][107][108] y medio a la síntesis a gran escala[109] están disponibles comercialmente.

Síntesis de oligonucleótidos mediados a gran escala - una historia

Sintetizadores de oligonucleótidos a gran escala fueron desarrolladas a menudo por aumentar las capacidades de una plataforma de instrumentos preexistentes. Uno de los primeros mediados escala sintetizadores aparecieron a finales de 1980, fabricado por la empresa Biosearch en Novato, CA (el 8800). Esta plataforma fue originalmente diseñada como un sintetizador de péptidos y hace uso de un reactor de lecho fluidizado esencial para acomodar las hinchazón características de poliestireno soportes utilizados en la metodología de Merrifield.[110] Síntesis de oligonucleótidos implicó el uso de GPC (vidrio de poro controlado) que es un soporte rígido y es más adecuado para reactores de columna como se describió anteriormente. La escala de la 8800 fue limitada a la tasa de flujo requerida para fluidificar el apoyo. Algunos reactores nuevos diseños así como superior a la presión normal habilitado el 8800 para alcanzar escalas que prepararían 1 mmole de oligonucleótidos. A mediados de 1990 varias compañías desarrollaron plataformas que se basan en Cromatógrafos líquidos preparativas y semi-preparativa. Estos sistemas eran muy adecuados para un enfoque de reactor de columna. En la mayoría de los casos todo lo que necesitaba era aumentar la cantidad de líquidos que podrían ser entregados a la columna. Síntesis de OLIGO requiere un mínimo de 10 y Cromatógrafos de líquido generalmente acomodar 4. Esta fue una tarea fácil y algunas estrategias semiautomáticas trabajados sin ninguna modificación en el equipo de LC preexistente. PerSeptive Biosystems como Pharmacia (GE) fueron dos de varias empresas que desarrollaron sintetizadores de Cromatógrafos líquidos. Tecnologías genómicas, Inc.[111] fue una de las pocas empresas a desarrollar un sintetizador de oligonucleótidos de gran escala que fue de la tierra para arriba, un sintetizador de oligonucleótidos. La plataforma inicial llamada la VLSS para el sintetizador a muy gran escala utiliza grandes columnas de cromatografía líquida de Pharmacia como reactores y podría sintetizar hasta 75 milimoles de material. Muchas fábricas de síntesis del oligonucleótido había diseñado y fabrican sus propias plataformas personalizadas y poco se sabe debido a los diseños están patentados. El diseño VLSS continuado ser refinado y se continúa en el sintetizador de QMaster [112] que es una escala hacia abajo de la plataforma que proporciona miligramo a gramo cantidades de oligonucleótidos sintéticos.

Las prácticas actuales de síntesis de oligonucleótidos modificados químicamente en gran escala han sido recientemente revisadas.[113]

Síntesis de los microarrays de oligonucleótidos

Artículo principal: DNA microarray § fabricación

Uno puede visualizar un microarrays de oligonucleótidos como placa multi-bien miniatura donde intencionalmente se quitan separadores físicos entre los pozos (paredes de plástico). Con respecto a la química, síntesis de los microarrays de oligonucleótidos es diferente de la síntesis del oligonucleótido convencional en dos sentidos:

5'- ONucleósido - MeNPOC protegidos phosphoramidite.
  • Oligonucleótidos permanecen fija a la fase sólida, que requiere el uso de conectores que son estables bajo las condiciones del procedimiento final de desprotección.
  • La ausencia de división física entre los sitios ocupados por los oligonucleótidos, un espacio muy limitado en la superficie de los microarrays (una secuencia de oligonucleótidos ocupa un cuadrado de 25 × 25 μm)[114] y el requisito de alta fidelidad de la síntesis de oligonucleótidos de dictar el uso de las técnicas de sitio selectivo 5'-desprotección. En una aproximación, la eliminación de la 5'-OGrupo - DMT es afectada por la generación electroquímica de ácido en el sitio requerido.[115] Otro enfoque usa 5'-O-(Α-Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl) (MeNPOC) protección de grupo, que puede ser eliminado por irradiación con luz UV de longitud de onda de 365 nm.[114]

Procesamiento post-sintético

Después de completar el montaje de la cadena, el oligonucleótido enlazado a soporte sólido está totalmente protegida:

  • El Grupo 5'-hidroxilo 5'-terminal está protegido con grupo DMT;
  • El fosfato internucleosidic o moieties fosfotioato están protegidos con grupos de 2-cyanoethyl;
  • Los grupos aminoácidos exocyclic en todas las bases excepto T y nucleicos están protegidos con protección de los grupos acilo.

Para equipar un oligonucleótido funcional, todos los grupos de protección han de ser eliminados. La protección de base de N-acil y el fosfato 2-cyanoethyl puede ser y se quita a menudo simultáneamente con el tratamiento con bases inorgánicas o aminas. Sin embargo, la aplicabilidad de este método está limitada por el hecho de que la división de protección del fosfato de 2-cyanoethyl da lugar a acrilonitrilo como productos secundarios. Bajo las fuertes condiciones básicas necesarias para la eliminación de la protección de N-acil, acrilonitrilo es capaz de alquilación de bases nucleicos, principalmente, en la N3-posición de residuos de timina y uracilo para dar el respectivo N3-(2-cyanoethyl) aductores a través de Reacción de Michael. La formación de estos productos secundarios puede evitarse tratando los sólido soporte enlazado oligonucleótidos con soluciones de bases en un solvente orgánico, por ejemplo, con el 50% trietilamina en acetonitrilo[116] o 10% Dietilamina en acetonitrilo.[117] Este tratamiento se recomienda para la mediana y gran escala preparados y es opcional para las síntesis a pequeña escala donde la concentración de acrilonitrilo en la mezcla de desprotección es baja.

Independientemente de si los grupos de protección del fosfato fueron quitados en primer lugar, los sólido soporte enlazado oligonucleótidos son deprotected utilizando uno de los dos enfoques generales.

  • (1) más a menudo, Grupo 5'-DMT se retira al final de la Asamblea de cadena de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos se liberación luego de la fase sólida y deprotected (base y fosfato) por tratamiento con acuoso hidróxido de amonio, acuoso metilamina, sus mezclas,[40] amoníaco gaseoso o metilamina[118] o, menos comúnmente, las soluciones de otras aminas primarias o álcalis a temperatura ambiente o elevada. Esto elimina todos los grupos de protección restante de 2'-deoxyoligonucleotides, dando por resultado una mezcla de reacción que contiene el producto deseado. Si el oligonucleótido contiene cualquier 2'-O-residuos de ribonucleótido protegida, el protocolo de desprotección incluye el segundo paso donde 2'-O-protección de sililo grupos se eliminan por el tratamiento con iones de flúor mediante diversos métodos.[119] El producto deprotected totalmente se utiliza como es, o el oligonucleótido deseado puede ser purificado por un número de métodos. Por lo general, el producto crudo es desalado utilizando precipitación del etanol, Cromatografía por exclusión de tamaño, o HPLC de fase inversa. Para eliminar productos no deseados de truncamiento, los oligonucleótidos pueden ser purificados a través de poliacrilamida electroforesis en gel de o intercambio aniónico HPLC seguida de la desalación.
  • (2) el segundo enfoque se utiliza únicamente cuando el método previsto de purificación es HPLC de fase inversa. En este caso, el grupo DMT de 5'-terminal que sirve como asa hidrofóbico para la purificación se mantiene el final de la síntesis. El oligonucleótido es deprotected bajo condiciones básicas, como se describe anteriormente y, por evaporación, se purifica por HPLC de fase inversa. El material recolectado es entonces detritylated en condiciones ácidas acuosas. En pequeña escala (menos de 0.01 – 0.02 mmol), el tratamiento con ácido acético acuoso al 80% para 15-30 min a temperatura ambiente se utiliza a menudo seguida por la evaporación de la mezcla de reacción a sequedad en vacío. Finalmente, el producto es desalado como se describió anteriormente.
  • Para algunas aplicaciones, grupos de reportero adicionales pueden acoplarse a un oligonucleótido usando una variedad de procedimientos post-sintéticos.

Caracterización

Deconvoluted MS ES de oligonucleótidos crudo 5'-DMT-T 20 (calcula masa 6324.26 Da).

Como con cualquier otro compuesto orgánico, conviene caracterizar de oligonucleótidos sintéticos en su preparación. En casos más complejos (investigación y síntesis a gran escala) oligonucleótidos se caracterizan después de su desprotección y purificación. Aunque es el último acercamiento a la caracterización secuencia, un procedimiento relativamente barato y rutinario, las consideraciones de la reducción de costes impiden su uso en la fabricación de rutina de los oligonucleótidos. En la práctica del día a día, es suficiente para obtener la masa molecular de un oligonucleótido registrando su espectro de masas. Dos métodos son actualmente ampliamente utilizados para la caracterización de oligonucleótidos: espectrometría de masas por electrospray (ES MS) y desorción/ionización láser asistida por matriz tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF). Para obtener el espectro informativo, es muy importante para el intercambio de los iones metálicos que pueden estar presentes en la muestra de amonio o trialkylammonium [c.e. Trietilamonio, (C2H5)3NH+] los iones antes de enviar una muestra para el análisis de cualquiera de los métodos.

  • ES MS espectro, un oligonucleótido determinado genera un conjunto de iones que corresponden a Estados diferentes de la ionización del compuesto. Así, el oligonucleótido con masa molecular M genera iones con masas (M – nH) /n donde M es la masa molecular de oligonucleótidos en la forma de un ácido libre (todas las cargas negativas de grupos fosfodiéster internucleosidic se neutralizan con H+), n es el estado de ionización, y H es la masa atómica de hidrógeno (1 Da). Son más útiles para la caracterización de los iones con n desde 2 hasta 5. Software suministrado con los instrumentos más recientemente manufacturados es capaz de realizar un deconvolución procedimiento es decir, se encuentra picos de iones que pertenecen al mismo grupo y se deriva la masa molecular de los oligonucleótidos.
  • Para obtener más información detallada sobre el perfil de impurezas de oligonucleótidos, cromatografía líquida-espectrometría de (LC / MS o HPLC-MS)[120] o espectrometría de masas en electroforesis capilar (CEMS)[121] se utilizan.

Véase también

  • Ácidos nucleicos
  • Análogos de ácidos nucleicos
  • Péptido de ácido nucleico
  • Puente de ácidos nucleicos

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Enlaces externos

  • Calculadora de oligonucleótidos – Bio-síntesis

Lectura adicional

  • Química de productos naturales integrales, volumen 7: ADN y aspectos de la Biología Molecular. Kool, Eric T., Editor. Holanda (1999), 733 págs. editorial: (Elsevier, Amsterdam, Holanda)
  • Beaucage, S. L.; Iyer, P. R. (1992). "Avances en la síntesis de oligonucleótidos por el método phosphoramidite". Tetraedro 48:: 2223-2311. doi:10.1016/s0040-4020 (01) 88752-4.
  • Beaucage, S. L.; Iyer, P. R. (1993). "La funcionalización de los oligonucleótidos via phosphoramidite derivados". Tetraedro 49:: 1925 – 1963. doi:10.1016/s0040-4020 (01) 5 86295.
  • Beaucage, S. L.; Iyer, P. R. (1993). "La síntesis de oligonucleótidos modificados por el enfoque phosphoramidite y sus aplicaciones". Tetraedro 49:: 6123-6194. doi:10.1016/s0040-4020 (01) 87958-8.
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