Abrazadera del remiendo

Un antibacteriano spheroplast parcheado con una pipeta de vidrio

Una grabación de patch clamp de corriente revela las transiciones entre dos Estados de la conductancia de un canal del ion sola: cerradas (en la parte superior) y abiertas (en la parte inferior).

El técnica de patch clamp es un técnica de laboratorio en Electrofisiología permite el estudio de uno o varios canales del ion en células de. La técnica puede aplicarse a una amplia variedad de células, pero es especialmente útil en el estudio de las células excitables tales como neuronas, cardiomiocitos, fibras musculares, y pancreático células beta. También se puede aplicar al estudio de bacteriana canales del ion en gigante especialmente preparado Esferoplastos.

La técnica de patch clamp es un refinamiento de la abrazadera de tensión. Erwin Neher y Bert Sakmann desarrollado la abrazadera del remiendo en la década de 1970 y principios de los ochenta. Este descubrimiento hizo posible registrar las corrientes de las moléculas de canal de iones solo por primera vez, que mejoraron la comprensión de la participación de los canales en procesos celulares fundamentales tales como potenciales de acción y la actividad del nervio. Neher y Sakmann recibida el Premio Nobel en fisiología o medicina en 1991 para este trabajo.

Técnica básica

Puesta en marcha

Revisión clásica abrazadera instalación, con microscopio, mesa antivibraciones, y micromanipuladores

Parche abrazadera grabación utiliza un vaso micropipeta una pipeta de parche se llama como una grabación electrodo dey el otro electrodo en el baño alrededor de la célula, como una referencia tierra electrodo. Dependiendo de lo que el investigador está tratando de medir, el diámetro de la punta de la pipeta utilizada puede variar, pero está generalmente en la Micrómetro rango. Este pequeño tamaño se utiliza para encerrar un membrana superficie o "parche" que a menudo contiene sólo una o pocas moléculas de canal de ion. Este tipo de electrodo es distinta del «microelectrodo sharp"utilizado para perforar las células tradicionales grabaciones intracelulares, que está sellado en la superficie de la membrana de la célula, en lugar de insertado a través de él.

Representación esquemática de un dispositivo de tirador de la pipeta utilizado para preparar Micropipetas para la abrazadera del remiendo y otras grabaciones

En algunos experimentos, se calienta la punta de la micropipeta en un microforge para producir una superficie lisa que ayuda en la formación de una alta resistencia sello con la membrana celular. Para obtener este sello de alta resistencia, la micropipeta se presiona contra una membrana de la célula y se aplica succión. Una porción de la membrana celular es succionada dentro de la pipeta, creando un Omega-en forma de área de membrana que si formado adecuadamente, crea una resistencia de 10 – 100 Gigaohms gama, llamado "gigaohm sello" o "gigaseal". La alta resistencia de este sello permite aislar electrónicamente las corrientes medidas a través del parche de membrana con poca competencia ruido, además de proporcionar cierta estabilidad mecánica a la grabación.

Según el experimento, el interior de la pipeta puede ser llenado con una solución que empareja la composición iónica de la solución del baño, como en el caso de la célula-grabación, o emparejar el citoplasma, para la grabación de célula entera. El investigador también puede cambiar el contenido o concentración de estas soluciones mediante la adición de iones o medicamentos para el estudio de los canales de iones bajo diferentes condiciones.

Grabación

Abrazadera del remiendo de una célula del nervio dentro de un trozo de tejido cerebral. La pipeta en la fotografía se ha marcado con un ligero color azul.

Muchos amplificadores de abrazadera del remiendo no utilizan true abrazadera de tensión circuitos, pero en cambio son amplificadores diferenciales Utilice el electrodo baño para establecer cero corriente (nivel del suelo). Esto permite a un investigador mantener la tensión constante mientras observa los cambios en actual. Para hacer estas grabaciones, la pipeta de parche es comparada con el electrodo de tierra. Luego se inyecta corriente en el sistema para mantener un voltaje constante, establecer. Sin embargo mucho corriente se necesita para fijar el voltaje es opuesta en signo e igual en magnitud a la corriente a través de la membrana.

Por otra parte, la célula puede ser corriente fijada en modo de celulares, mantenimiento corriente constante mientras observa cambios en la membrana tensión.

Variaciones

Diagrama que muestra las variaciones de la técnica de patch clamp

Varias variaciones de la técnica básica se pueden aplicar, dependiendo de lo que el investigador quiere estudiar. Las técnicas de interior y exterior se llaman técnicas "suprimido parche", porque el parche es suprimido (retirado) del cuerpo principal de la célula. Conexión celular y ambas técnicas parche suprimido se utilizan para estudiar el comportamiento de canales iónicos individuales en la sección de membrana conectada al electrodo.

Celulares parche y parche perforada permiten el investigador estudiar el comportamiento eléctrico de la célula entera, en lugar de las corrientes de canal único. El parche de células completas, que permite el acceso eléctrico de baja resistencia en el interior de una célula, ahora ha substituido en gran parte microelectrodo de alta resistencia técnicas a las corrientes registros de grabación a través de la membrana de la célula entera.

Parche conexión celular

Configuración de parche Cell-attached

Para este método, la pipeta se sella en la membrana celular para obtener una gigaseal, asegurándose que la membrana celular permanece intacta. Esto permite la grabación de las corrientes a través de canales del ion sola, o varias, contenidas en el parche de membrana por la pipeta. Uniendo solamente en el exterior de la membrana celular, existe muy poca alteración de la estructura celular. También, por no perturbar el interior de la célula, mecanismos intracelulares normalmente, que influyen en el canal serán siendo capaces de funcionar como fisiológicamente. Usando este método también es relativamente fácil de obtener la configuración correcta y una vez obtenido es bastante estable.

Para canales ligand-bloqueados del ion o canales que son modulados por receptores metabotrópicos, la neurotransmisor o drogas estudiadas se incluyeron generalmente en la solución de la pipeta, donde puede interactuar con lo que solía ser la superficie externa de la membrana. La actividad del canal resultante puede atribuirse a la droga que se utiliza, aunque generalmente no es posible entonces cambiar la concentración del fármaco dentro de la pipeta. La técnica es así limitada a un punto en un curva de dosis respuesta por parche. Por lo tanto, la respuesta a la dosis se logra usando varias células y parches. Sin embargo, canales voltaje-bloqueados del ion puede sujetarse sucesivamente en potenciales de membrana diferentes en un solo parche. Esto produce activación de canal como una función del voltaje y una completa Curva i-v (corriente / tensión) se puede establecer en sólo un parche. Otro posible inconveniente de esta técnica es que, así como las vías intracelulares de la célula no son perturbadas, no se puede directamente modificar cualquiera.

Parche de adentro hacia afuera

Configuración de parche de adentro hacia afuera

En el método de dentro hacia fuera, un remiendo de la membrana se une a la pipeta patch, separada del resto de la célula y la superficie citosólica de la membrana está expuesta a los medios externos, o baño. Una de las ventajas de este método es que el experimentador tiene acceso a la superficie intracelular de la membrana mediante el baño y puede cambiar la composición química de lo que se expone a la superficie de la membrana. Esto es útil cuando un experimentador desea manipular el medio ambiente en la superficie intracelular de canales iónicos individuales. Por ejemplo, canales que son activados por ligandos intracelulares pueden entonces estudiarse a través de una gama de concentraciones de ligando.

Para lograr la configuración de dentro hacia fuera, la pipeta se une a la membrana celular como en el modo de conexión celular, formando un gigaseal y luego se retrae para romper un trozo de membrana del resto de la célula. Sacar un parche de membrana a menudo produce inicialmente la formación de un vesícula de de membrana en la punta, debido a los extremos de la membrana del parche se fusionan rápidamente después de la supresión. La cara externa de la vesícula debe entonces ser quebrada se abren para entrar en modo de adentro hacia afuera; Esto puede hacerse tomando brevemente la membrana a través de la interfaz de solución/aire baño, por exposición a una baja Ca²⁺ solución, o momentáneamente haciendo contacto con una gota de parafina o un pedazo de silicona polímero.

Grabación de célula entera o parche de células completas

Configuración de parche de células completas

Grabaciones de celulares incluyen grabación de corrientes a través de múltiples canales simultáneamente, sobre la membrana de la célula entera. El electrodo se deja en lugar en la célula, como en grabaciones de celular conectado, pero más succión se aplica para romper el parche de membrana, dando acceso desde el interior de la pipeta al espacio intracelular de la célula. Una vez que la pipeta se une a la membrana celular, hay dos métodos para romper el parche. La primera es mediante la aplicación de succión más. La cantidad y la duración de esta aspiración depende del tipo de célula y el tamaño de la pipeta. El otro método requiere un gran pulso de corriente a ser enviados a través de la pipeta. Cuanta corriente es aplicada y la duración del pulso también dependen del tipo de célula. Para algunos tipos de células, es conveniente aplicar ambos métodos simultáneamente para romper el parche.

La ventaja de la abrazadera del remiendo de célula entera grabando sobre grabación de microelectrodo sharp es que la abertura más grande en la punta del electrodo pinza parche ofrece menor resistencia y así mejor eléctrico acceso al interior de la célula. Una desventaja de esta técnica es que porque el volumen del electrodo es mayor que el volumen de la célula, el contenido soluble del interior de la célula poco a poco se reemplazará por el contenido del electrodo. Esto se conoce como electrodo "diálisis" contenido de la celda. Después de un tiempo, las propiedades de la célula dependen de contenido intracelular soluble se verá alteradas. Aproxima a la solución de la pipeta utilizada generalmente alta-potasio medio ambiente del interior de la célula para reducir al mínimo los cambios que esto puede causar. En términos generales, existe un periodo al principio de una grabación de célula entera, dura aproximadamente 10 minutos, cuando uno puede tomar medidas antes de que la célula ha sido dializaron.

Exterior-out patch

Técnica de formación de exterior-out patch. En orden: superior izquierda, superior derecha, inferior izquierda, inferior derecha

El nombre «fuera-fuera"enfatiza la complementariedad de ambos esta técnica a la técnica de adentro hacia afuera y el hecho de que coloca la superficie externa en lugar de intracelular de la membrana celular en el exterior del parche de membrana, en lo referente a los electrodos de parche.

La formación de un parche en el exterior-out comienza con una configuración de registro de celulares. Después de la configuración de célula entera es formada, el electrodo se retira lentamente de la célula, lo que permite una bombilla de la membrana ampolla fuera de la célula. Cuando el electrodo es lo suficientemente lejos, esta ampolla se separará de la célula y la reforma como una membrana convexa en el extremo del electrodo (como una bola abierta en la punta del electrodo), con el original fuera de la membrana hacia el exterior del electrodo. Como se muestra en la imagen a la derecha, esto significa que el líquido dentro de la pipeta se simulando el líquido intracelular, mientras que un investigador es libre de mover la pipeta y la ampolla con sus canales a otro baño de solución. Mientras que varios canales pueden existir en una ampolla de membrana, solo canal grabaciones también son posibles en esta conformación si la ampolla de membrana individual es pequeña y sólo contiene un canal.

Exterior a remendar el experimentador la oportunidad para examinar las propiedades de un canal iónico cuando es aislado de la célula y expuesto sucesivamente a diferentes soluciones en la extracelular superficie de la membrana. El experimentador puede inundar el mismo parche con una variedad de soluciones en un periodo relativamente corto de tiempo, y si el canal es activado por un neurotransmisor o drogas de la cara extracelular, un respuesta a la dosis luego puede obtenerse la curva. Esta capacidad para medir la corriente a través de exactamente la misma pieza de membrana en diferentes soluciones es la clara ventaja del parche exterior-out en relación con el método de células adheridas. Por otro lado, es más difícil de lograr. El largo proceso de formación implica más pasos que podrían fallar y resulta en una menor frecuencia de parches utilizables.

Parche perforado

Técnica del remiendo perforada

Esta variación del método patch clamp es muy similar a la configuración de célula entera. La principal diferencia radica en el hecho de que cuando el experimentador forma el sello gigaohm, succión no se utiliza para romper la membrana del parche. En cambio, la solución del electrodo contiene pequeñas cantidades de un antifúngico o antibiótico agente, tales como amphothericin-B, nistatina, o gramicidina, que se difunde en el parche de membrana y forma pequeños poros en la membrana, proporcionando acceso eléctrico para el interior de la célula. Cuando se comparan los métodos parche celulares y perforados, uno puede pensar del parche de célula entera como una puerta abierta, en la cual hay intercambio completo entre moléculas en la solución de la pipeta y el citoplasma. El parche perforado puede compararse a una puerta de pantalla que sólo permite el intercambio de ciertas moléculas de la solución de la pipeta hacia el citoplasma de la célula.

Ventajas del método parche perforado, en relación con grabaciones de celulares, son las propiedades de los antibióticos poros, que permiten equilibrar sólo de iones monovalentes pequeños entre la pipeta patch y el citosol, pero no de moléculas grandes que no pueden penetrar por los poros. Esta propiedad mantiene niveles endógenos de iones divalentes como Ca²⁺ y moléculas de señalización como Campamento. Por lo tanto, uno puede tener grabaciones de toda la célula, como parche de célula entera sujeción, conservando más mecanismos de señalización intracelulares, como en grabaciones de conexión celular. Como resultado, hay Resumen actual reducido y estable parche perforado las grabaciones pueden durar más de una hora. Desventajas incluyen una mayor resistencia de acceso, con respecto a celulares, debido a la membrana parcial ocupando la punta del electrodo. Esto puede disminuir la resolución actual y aumentar el ruido de la grabación. También puede tomar una cantidad significativa de tiempo para que el antibiótico a perforar la membrana (unos 15 minutos para amphothericin-B y aún más para la gramicidina y nistatina). La membrana bajo la punta del electrodo es debilitada por las perforaciones por el antibiótico y puede romperse. Si rompe el parche, la grabación es en el modo de células completas, con antibióticos contamina el interior de la célula.

Parche suelto

Técnica de abrazadera del remiendo flojo

Abrazadera del remiendo flojo es diferente de las otras técnicas discutidas aquí en que emplea un sello suelto (baja resistencia eléctrica) en lugar de la apretada gigaseal utilizado en la técnica convencional. Esta técnica fue utilizada desde el año 1961, como se describe en un documento por Strickholm la impedancia de la superficie de la célula muscular, pero recibió poca atención hasta ser traído para arriba otra vez y dado un nombre por Almers, Stanfield y Stühmer en 1982, después de abrazadera del remiendo se estableció como una importante herramienta de electrofisiología.

Para lograr una abrazadera del remiendo flojo sobre una membrana de la célula, la pipeta se mueve lentamente hacia la célula, hasta que la resistencia eléctrica de contacto entre la célula y los aumentos de la pipeta a unos pocos veces mayor resistencia que la del electrodo solo. Más la pipeta llega a la membrana, mayor será que la resistencia de la punta de la pipeta se convierte, pero si muy cerca un sello está formado, y podría llegar a ser difícil de quitar la pipeta sin dañar la célula. Para la técnica del remiendo flojo, la pipeta no acercarse lo suficiente a la membrana para formar una gigaseal o una conexión permanente, ni para perforar la membrana de la célula. La membrana celular permanece intacta, y la falta de un sello hermético crea un pequeño hueco a través del cual pueden pasar iones fuera de la célula sin necesidad de introducir la pipeta.

Una ventaja importante del sello suelto es que la pipeta que se utiliza se puede quitar varias veces de la membrana después de la grabación, y la membrana permanecerá intacta. Esto permite mediciones repetidas en una variedad de localizaciones en la misma celda sin destruir la integridad de la membrana. Esta flexibilidad ha sido especialmente útil a los investigadores para el estudio de las células musculares que contraen en condiciones fisiológicas reales, obtener grabaciones rápidamente y hacerlo sin recurrir a medidas drásticas para parar las fibras musculares de la contratación. Una desventaja importante es que la resistencia entre la pipeta y la membrana se reduce, permitiendo que la corriente de fuga a través de la Junta y reduciendo significativamente la resolución de pequeñas corrientes. Esta fuga puede corregirse parcialmente para, sin embargo, que ofrece la oportunidad de comparar y contrastar las grabaciones hechas desde diferentes áreas de la célula de interés. Ante esto, se ha estimado que la técnica del remiendo flojo puede resolver las corrientes menores que 1 mA/cm².

Parche automático de sujeción

Automatizado de abrazadera del remiendo sistemas han desarrollado recientemente, con el fin de recoger grandes cantidades de datos de bajo costo en un período corto de tiempo. Tales sistemas incluyen típicamente un solo uso microfluídicos dispositivo, ya sea un moldeado por inyección o un polidimetilsiloxano (PDMS) fundición de viruta, para capturar a una célula o células y un electrodo integrado.

En una forma de un sistema automatizado, un diferencial de presión se utiliza para forzar las células estudiadas para ser dibujado hacia la pipeta abriendo hasta formar un gigaseal. A continuación, exponiendo brevemente la punta de la pipeta a la atmósfera, la porción de la membrana que sobresalen de las ráfagas de la pipeta y la membrana está ahora en la conformación de adentro hacia afuera, en la punta de la pipeta. En un sistema totalmente automatizado, la pipeta y el parche de membrana pueden entonces rápidamente mover a través de una serie de soluciones de ensayo diferentes, permitiendo que diferentes compuestos ser aplicado al lado intracelular de la membrana durante la grabación.

Véase también

• Bioelectrónica
• Teoría del cable
• Channelome
• Channelomics
• Ecuación de flujo GHK
• Ecuación de Goldman
• Matriz micropozo-microcanal
• Abrazadera planar del remiendo
• Sector preparación

Enlaces externos

• Imágenes alternativas de variaciones de patch clamp
• Animación del método de Patch Clamp

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