Amplificación Multiplex de ligadura dependiente de sonda

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Amplificación Multiplex de ligadura dependiente de sonda (MLPA)[1] es una variación del multiplex reacción en cadena de polimerasa que permite que múltiples objetivos para ser amplificados con solamente un solo cartilla de par.[1] Cada prueba consta de dos oligonucleótidos que reconocen sitios de destino adyacente en el DNA. Un oligonucleótido de la sonda contiene el secuencia de reconocido con el primer avance, el otro contiene la secuencia reconocida por la cartilla reversa. Sólo cuando ambos oligonucleótidos sonda están hibridizados para sus respectivos objetivos, pueden ser ligada en una punta de prueba completa. La ventaja de dividir la prueba en dos partes es que sólo los oligonucleótidos ligados, pero no los oligonucleótidos de sonda no unida, se amplifican. Si los sondeos no se dividieron de esta manera, las secuencias de la cartilla en cada extremo haría que las puntas de prueba ser amplificados independientemente de su hibridación a la plantilla de ADN, y el producto de amplificación no sería dependiente sobre el número de sitios de destino presentes en el ADN de la muestra. Cada sonda completa tiene una longitud única, por lo que su resultante amplicones pueden ser separados e identificado por (tubo capilar) electroforesis. Esto evita las limitaciones de resolución de PCR Multiplex. Porque el primer avance utilizado para la amplificación de la sonda es fluorescencia etiquetado, cada amplicón genera un pico fluorescente que puede ser detectado por un secuenciador capilar. Comparando el patrón de pico obtenido en una muestra determinada con la obtenida en varias muestras de referencia, se puede determinar la cantidad relativa de cada amplicón. Este ratio es una medida de la proporción en que la secuencia de destino está presente en el ADN de la muestra.

MLPA in GeneMarker.jpg

Varias técnicas incluyendo (DGGEDesnaturalizando electroforesis del Gel del gradiente), (DHPLCDesnaturalización de la cromatografía líquida de alto rendimiento), y SSCA (análisis de la conformación de filamento único) efectivamente identificar SNPs y pequeñas inserciones y deleciones. MLPA, sin embargo, es una de las técnicas para la detección genómicas deleciones e inserciones (exones todo uno o más), que son causas frecuentes de cánceres como el cáncer colorrectal hereditario no poliposis (sólo precisas y eficienteHNPCC), mama y ovario. MLPA puede fácilmente y con éxito determinar el número relativo de copia de todos los exones de un gen simultáneamente con alta sensibilidad.

Contenido

  • 1 Ploidía relativa
  • 2 Análisis de cociente de la dosis
  • 3 Ventajas de MLPA
  • 4 Aplicaciones de MLPA
  • 5 Referencias
  • 6 Enlaces externos

Ploidía relativa

Un uso importante de MLPA es determinar relativa ploidía. Por ejemplo, pueden diseñarse sondas a diferentes regiones de cromosoma de 21 de una célula humana. Los puntos fuertes de la señal de las sondas se comparan con los obtenidos de una muestra de ADN de referencia conocida para tener dos copias del cromosoma. Si una copia extra está presente en la muestra, se espera que las señales sean 1.5 veces las intensidades de las sondas respectivas de la referencia. Si solamente una copia está presente se espera que la proporción sea 0,5. Si la muestra tiene dos copias, la fuerza relativa de la sonda se espera que sean iguales.

Análisis de cociente de la dosis

Análisis del cociente de dosis es el método habitual de interpretar datos MLPA.[2] Si a y b son las señales de dos amplicones en la muestra del paciente, y A y B son los amplicones correspondientes en el control experimental, entonces el cociente de dosis DQ = (a / b) / (A / B). Aunque cocientes de dosis pueden ser calculados para cualquier par de amplicones, es generalmente el caso que uno de la pareja es una sonda de referencia interna.

Ventajas de MLPA

MLPA facilita la amplificación y detección de objetivos múltiples con un par de primer single. En una reacción de polimerización en cadena múltiplex estándar, cada fragmento necesita un único par de cartilla amplificación. Estas cartillas están presentes en gran cantidad causar diversos problemas como la dimerización y oscurecimiento falso. Con MLPA, se logra la amplificación de las sondas. Así, muchas secuencias (hasta 40) pueden ser amplificadas y cuantificaron usando sólo un par de primer single. Reacción de MLPA es rápido, barato y muy sencillo de realizar.

Aplicaciones de MLPA

MLPA tiene una variedad de aplicaciones[3] incluyendo la detección de mutaciones y polimorfismos de nucleótido único,[4] Análisis de la DNA metilación,[5] relativa mRNA cuantificación,[6] Caracterización cromosómica de líneas celulares y muestras de tejidos,[7] detección de número de copias del gen,[8]detección de duplicaciones y deleciones en humanos cáncer genes de predisposición tales como BRCA1, BRCA2, hMLH1 y hMSH2[9] y aneuploide determinación.[10] MLPA tiene aplicación potencial en diagnóstico prenatal ambos invasor[11] y no invasiva.[12]

Referencias

  1. ^ Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Modehuis D, F Diepvens, Pals G (2002). "Cuantificación relativa de 40 secuencias de ácidos nucleicos por amplificación múltiplex sonda de ligadura dependientes". Ácidos nucleic Res. 30 (12): e57. doi:10.1093/Nar/gnf056. PMC117299. PMID12060695.
  2. ^ Yau SC, Bobrow M, Mathew CG, Abbs SJ (1996). "La diagnosis exacta de portadores de deleciones y duplicaciones en la distrofia muscular de Duchenne/Becker mediante análisis de dosis fluorescentes". J MED Genet. 33 (7): 550-558. doi:10.1136/JMG.33.7.550. PMC1050661. PMID8818939.
  3. ^ Articulos relacionados a lista de MLPA
  4. ^ Volikos E, Robinson J, Aittomaki K, JP Mecklin, Jarvinen H, Westerman AM, Rooji de FW, Vogel T, Moeslein G, Launonen V, Tomlinson IP, AR del plata, LA de Aaltonen (2006). "Canceladuras del gene entero y exonic LKB1 son una causa común de síndrome de Peutz‐Jeghers". J MED Genet. 43 (5): e18. doi:10.1136/JMG.2005.039875. PMC2564523. PMID16648371.
  5. ^ Procter M, Chou LS, Tang W, Jama M, Mao R (2006). "Diagnóstico molecular de Prader-Willi y Síndromes de Angelman por análisis de fusión específica de metilación y amplificación específica de metilación dependiente de ligadura multiplex sonda. Clin. Chem. 52 (7): 1276-1283. doi:10.1373/clinchem.2006.067603. PMID16690734.
  6. ^ Wehner M, Mangold E, Sengteller M, N de Friedrichs, Aretz S, Friedl W, Apuntalamiento P, Pagenstecher C (2005). "Cáncer colorrectal hereditario sin Poliposis: dificultades en la detección de la deleción en genes MSH2 y MLH1". EUR j Hum. Genet. 13 (8): 983 – 986. doi:10.1038/sj.ejhg.5201421. PMID15870828.
  7. ^ Marchitez SM, Snijders PJ, Meijer GA, Ylstra B, Van den IJssel PR, Snijders AM, DG de Albertson, J Coffa, JP Schouten, van de Wiel MA, Meijer CJ, Steenbergen RD (2006). "El gene mayor números de copia en el cromosoma 20q son frecuentes en carcinomas de células escamosas y adenocarcinomas del cuello uterino". J. Pathol. 209 (2): 220 – 230. doi:10.1002/path.1966. PMID16538612.
  8. ^ Introducción a la MLPA
  9. ^ Bunyan DJ Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, PJ Duncan, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cruz NC (2004). "Análisis de dosis de genes de predisposición del cáncer por la amplificación múltiplex sonda de ligadura dependientes". Fr. J. cáncer 91 (6): 1155-1159. doi:10.1038/sj.BJC.6602121. PMC2747696. PMID15475941.
  10. ^ Gerdes T, Kirchhoff M, Lind AM, Larsen GV, Schwartz M, C Lundsteen (2005). "Informática prenatal aneuploidia detección del cromosoma 13, 18, 21, X e Y basadas en la amplificación multiplex de ligadura dependiente de sonda (MLPA)". EUR j Hum. Genet. 13 (2): 171 – 175. doi:10.1038/sj.ejhg.5201307. PMID15483643.
  11. ^ Hochstenbach R, Meijer J, van de Brug J, Vossebeld-Hoff I, Jansen R, van der Luijt RB, RJ Sinke, GC página Christiaens, Ploos van Amstel JK, Pater de JM (2005). "Detección rápida de aneuploidías cromosómicas en amniocytes inculto por amplificación multiplex de ligadura dependiente de sonda (MLPA)". Prenat. Diagn. 25 (11): 1032-1039. doi:10.1002/PD.1247. PMID16231311.
  12. ^ Illanes S, Avent N, han PW (2005). "Sin células DNA fetal en plasma materno: un importante avance para enlazar genética fetal ultrasonido obstétrico". Ultrasonido Obstet. pCO.OOI 25 (4): 317 – 322. doi:10.1002/UOG.1881. PMID15789415.

Enlaces externos

  • Otras aplicaciones de MLPA
  • v
  • t
  • e
Reacción en cadena de polimerasa técnicas de
  • Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
  • Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR)
  • Reacción en cadena de polimerasa inversa
  • Reacción en cadena jerarquizada de polimerasa
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