Ensayo de cambio de movilidad electroforética
Un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis de turno movilidad, también conocido como un ensayo de cambio de gel, ensayo de cambio de movilidad de gel, ensayo de cambio de banda, o ensayo de retardo de gel, es un común electroforesis de afinidad técnica utilizada para el estudio de proteína – ADN o proteína–RNA interacciones. Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia dada de DNA o RNA y a veces puede indicar si más de una molécula de proteína está implicada en el enlace complejo. A menudo se realizan ensayos de cambio de gel en vitro concurrentemente con Huella de DNasa, extensión de la cartillay promotor-sonda experimentos al estudiar transcripción iniciación, réplica de la DNA, la reparación del ADN o procesamiento de RNA y la maduración. Aunque precursores se pueden encontrar en la literatura anterior, los análisis más actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin [1] y frito y Crothers.[2]
Principio de
Un análisis de cambio de movilidad es separación electroforética de una mezcla de proteína – ADN o proteína-RNA en una poliacrilamida o gel de agarosa por un período corto (aproximadamente 1.5-2 h para un gel de 15 - 20 cm).[3] La velocidad en que moléculas diferentes (y sus combinaciones) movimiento a través del gel es determinada por su tamaño y carga y en menor medida, su forma (véase electroforesis en gel de). El carril de control (sonda de ADN sin proteínas presentes) contendrá una única banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN independiente. Sin embargo, asumiendo que la proteína es capaz de atar al fragmento, el carril con proteína presente contendrá otra banda que representa el complejo más grande, menos movilidad de la sonda de ácido nucleico unida a proteína que es 'invertida' para arriba en el gel (puesto que se ha movido más lentamente).
Bajo las condiciones experimentales adecuadas, la interacción entre el ADN (o ARN) y proteína se estabiliza y la relación de dependiente a independiente ácidos nucleicos en gel refleja la fracción de las moléculas sonda libres y encuadernados como la reacción de enlace entra en el gel. Esta estabilidad es en parte debido a un efecto"jaulas", en que la proteína, rodeada por la matriz del gel, es incapaz de difundir lejos de la punta de prueba antes de que se recombinan.[4] Si se conocen las concentraciones a partir de proteína y probe, y si se conoce la estequiometría del complejo, podrá determinarse la afinidad aparente de la proteína para la secuencia de ácido nucleico.[5] A menos que el complejo se vive mucho tiempo bajo condiciones de gel, o disociación durante la electroforesis se toma en cuenta, el número derivado es aparentemente un Kd. Si no se conoce la concentración de proteína pero la estequiometría compleja, puede determinarse la concentración de proteína al aumentar la concentración de la sonda de ADN hasta incrementos de no aumentar la fracción de proteína limitada. En comparación con una serie de diluciones estándar de punta de prueba gratis en el mismo gel, puede calcularse el número de moles de proteína.[3]
Un anticuerpo que reconoce la proteína se puede agregar a esta mezcla para crear un complejo aún mayor con un cambio mayor. Este método se conoce como un ensayo de supercambioy se utiliza para identificar inequívocamente una proteína presente en las proteínas – ácidos nucleicos complejos.
A menudo, un carril adicional se ejecuta con un competidor oligonucleótidos para determinar la secuencia más favorable de Unión para la proteína. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite identificar el sitio de Unión precisa por la competencia (no se muestra en el diagrama). Variantes de la prueba de competencia son útiles para medir la especificidad de la Unión y para la medición de la cinética de asociación y disociación.
Una vez determinada la Unión de ADN-proteínas en vitro, un número de en silico algoritmos pueden restringir la búsqueda para la identificación de los factores de transcripción. Oligonucleótidos secuencia de consenso para el factor de transcripción de interés serán capaces de competir por el enlace, eliminando la banda cambió de puesto y deben ser confirmadas por supercambio. Si la secuencia de consenso prevista no compiten para el atascamiento, identificación de los factores de transcripción puede ayudado por multiplexado competidor EMSA (MC-EMSA), por el que grandes conjuntos de secuencias de consenso son multiplexados en cada reacción, y donde compite un sistema para la encuadernación, se ejecutan las secuencias consenso individuales de este conjunto en una reacción posterior.[6]
Para propósitos de visualización, el fragmento de ácido nucleico está marcado generalmente con una radiactivo, fluorescente o biotina etiqueta. Estándar bromuro de etidio la coloración es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad para detectar el ácido nucleico, si pequeñas cantidades de ácido nucleico o monocatenario nucleic acid(s) se utilizan en estos experimentos. Cuando se utiliza una etiqueta de biotina, estreptavidina Conjugado a una enzima como la peroxidasa se utiliza para detectar la DNA del fragmento (Revisión EMSA no radiactivo). Mientras que el etiquetado isotópico de ADN tiene poco o ningún efecto en la afinidad de unión a proteínas, uso de las etiquetas no-isotópico incluyendo flurophores o biotina puede alterar la afinidad o la estequiometría de la interacción de la proteína de interés. Competencia entre la sonda marcada con fluoróforo o biotina y DNA sin etiqueta de la misma secuencia puede utilizarse para determinar si la etiqueta altera la afinidad de unión o estequiometría.
Referencias
- ^ Garner MM, Revzin (julio de 1981). "Un método de electroforesis en gel para cuantificar el atascamiento de proteínas a regiones específicas de ADN: aplicación a los componentes del Escherichia coli lactosa operon sistema regulatorio". Ácidos nucleic Res. 9 (13): 3047-60. doi:10.1093/Nar/9.13.3047. PMC327330. PMID6269071.
- ^ Fried M, Crothers DM (diciembre de 1981). "Equilibrio y cinética de la interacción de operador represor lac por electroforesis en gel de poliacrilamida". Ácidos nucleic Res. 9 (23): 6505 – 25. doi:10.1093/Nar/9.23.6505. PMC327619. PMID6275366.
- ^ a b Ausubel, Frederick M. (1994). Protocolos actuales de en biología molecular. Chichester: John Wiley & Sons. págs. 12.2.1–11. ISBN0-471-50337-1.
- ^ Fried MG, Liu G. (1994). "Secuestro molecular estabiliza complejos CAP - ADN durante la electroforesis en gel de poliacrilamida". Investigación de ácidos nucleicos 22(23): 5054-5059. doi: 10.1093/nar/22.23.5054. PMID 7800499.
- ^ Fried MG (1989) "medición de parámetros de interacción proteína-ADN por turno de movilidad electroforesis de ensayo". Electroforesis 10, 366-376. PMID 2670548.
- ^ Smith AJ, Humphries SE (enero de 2009). "Caracterización de proteínas de unión al ADN mediante había multiplexado a competidor EMSA". J. análizar Biol 385 (3): 714 – 7. doi:10.1016/j.JMB.2008.11.035. PMID19059416.
Protocolos de
- Protocolo Dr. Mirmira EMSA
- Preparación del extracto nuclear para EMSA
- Protocolo de laboratorio Jonathan Flint
- EMSA para la transcripción del Factor vinculante
- Protocolo de cambio de Gel quimioluminiscente
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