Ensayo de complementación de proteínas-fragmento

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Ensayo de complementación de proteínas-fragmento, o PCA, es un método para la identificación de interacciones proteína – proteína en los sistemas biológicos. Se utiliza en el campo de la proteómica. En la PCA, las proteínas de interés ("Bait" y "Presa") son cada covalentemente ligado a incompletos fragmentos de una tercera proteína (e.g. DHFR, que actúa como un "reportero"). Interacción entre el "cebo" y las proteínas de "presa" reúne los fragmentos de la proteína "reportero" cerca suficiente para permitirles formar una proteína funcional reportero cuya actividad puede ser medido. Este principio puede aplicarse a muchas proteínas diferentes "reportero" y es también la base para la sistema del dos-híbrido de la levadura, un test arquetípico de la PCA.

Análisis de proteína de Split

PCA principle
Principio general de la prueba de complementación de proteínas: una proteína es dividida en dos mitades (N - y c-terminal) y reconstituida por dos proteínas interactuantes (aquí llamadas "cebo" y "presa" porque una proteína cebo puede utilizarse para encontrar una interacción proteína presa). La actividad de la proteína reconstituida debe ser fácilmente detectable, por ejemplo, como en el Proteína verde fluorescente (GFP).

Cualquier proteína que puede ser dividida en dos partes y reconstituida no covalente puede utilizarse en un PCA. Las dos partes solo hay que ser reunido por otras proteínas obran sobre ellos ("típicamente llamado cebo" y "presa" (ver figura). La proteína que produce una lectura perceptible se denomina "reportero". Generalmente las enzimas que confieren resistencia a los antibióticos, tales como Dihidrofolato reductasa o Beta-lactamasa, o proteínas que dan señales de colorimétricas o fluorescentes se utilizan como reporteros. Cuando las proteínas fluorescentes se reconstituyen el PCA se llama Ensayo de complementación bimolecular de la fluorescencia. Las siguientes proteínas se han utilizado en split proteína PCAs:

  • Dihidrofolato reductasa (DHFR)[1]
  • Beta-lactamasa[2][3]
  • Gal4 de la levadura (como en el clásico sistema del dos-híbrido de la levadura)
  • (TEV) SplitTabaco etch virus proteasa) [4]
  • Luciferasa,[5][6] incluyendo ReBiL (recombinase mejorado luciferase bimolecular)[7]
  • Ubiquitina[8]
  • GFP (GFP-split), e.g. EGFP (mejorado proteína verde fluorescente)[9][10][11]
  • (LacZbeta-galactosidasa)[12]
  • Proteína fluorescente infrarroja IFP1.4, una ingeniería cromóforo-dominio obligatorio (CBD) de un bacteriophytochrome de Deinococcus radiodurans [13]
  • Quinasa de adhesión focal (FAK)[14]

Enlaces externos

  • Ensayos de complementación de proteínas – fragmento: Una estrategia General para la detección in vivo de las interacciones proteína-proteína – un estudio en la revista de técnicas biomoleculares.

Notas de la

  1. ^ Tarassov, K.; Cúmulo globular, V.; Landry, C. R.; Radinovic, S.; Serna Molina, M. M. S.; Shames, I.; Malitskaya, Y.; Vogel, J.; Bussey, H.; Michnick, S. W. (2008). "Un en Vivo mapa del interactoma de proteína de la levadura". Ciencia 320 (5882): 1465-1470. doi:10.1126/Science.1153878. PMID18467557.editar
  2. ^ Park, J. H.; Espalda, J. H.; Hahm, S. H.; Shim, H. Y.; Park, J. M.; KO, S. I.; Han, S. Y. (2007). "Estrategia de complementación de fragmentación de beta-lactamasa bacteriana puede utilizarse como un método para la identificación de pares de proteínas interactuantes". Diario de la microbiología y biotecnología 17 (10): 1607-1615. PMID18156775.editar
  3. ^ Remy, I.; Ghaddar, G.; Michnick, S. W. (2007). "Utilizando el ensayo de complementación de fragmento de proteína de β-lactamasa para sondar interacciones proteína – proteína dinámica". Protocolos de la naturaleza 2 (9): 2302-2306. doi:10.1038/nprot.2007.356. PMID17853887.editar
  4. ^ Wehr, M. C.; Laage, R.; Bolz, U.; Fischer, T. M.; Grünewald, S.; Scheek, S.; Bach, A.; Nave, k. A.; Rossner, M. J. (2006). "Monitoreo de interacciones proteína-proteína regulada usando split TEV". Métodos de naturaleza 3 (12): 985-993. doi:10.1038/nmeth967. PMID17072307.editar
  5. ^ Cassonnet, P.; Rolloy, C.; Neveu, G.; Vidalain, p. O.; Chantier, T.; Pellet, J.; Jones, L.; Muller, M.; Demeret, C.; Gaud, G.; Vuillier, F. O.; Lotteau, V.; D. picante, f.; Favre, M.; Jacob, Y. (2011). "Un ensayo de complementación de luciferase para la detección de complejos proteicos de benchmarking". Métodos de naturaleza 8 (12): 990-992. doi:10.1038/nmeth.1773. PMID22127214.editar
  6. ^ Fujikawa, Y. et al (2014) Ensayo de complementación de luciferase Split para detectar las interacciones proteína-proteína regulada en protoplastos de arroz en un formato de gran escala. Arroz 7:11
  7. ^ Li, Y. C.; Rodewald, W. L.; Hoppmann, C; Wong, E. T.; Lebreton, S; Safar, P; Patek, M; Wang, L; Wertman, K. F.; Wahl, G. M. (2014). "Una plataforma versátil para analizar las interacciones de baja afinidad y transitoria de la proteína en células vivas en tiempo real". Informes celular 9 (5): 1946-58. doi:10.1016/j.celrep.2014.10.058. PMC4269221. PMID25464845.editar
  8. ^ Dünkler, A.; Müller, J.; Johnsson, N. (2012). "Detección de interacciones proteína – proteína con el Sensor de Split-ubiquitina". Redes de regulación génica. Métodos en Biología Molecular 786. págs. 115 – 130. doi:10.1007/978-1-61779-292-2_7. ISBN978-1-61779-291-5. PMID21938623.editar
  9. ^ Barnard, E.; Timson, J. D. (2010). "Split-EGFP pantallas para la detección y localización de las interacciones proteína – proteína en las células de levadura vivas". Molecular y métodos de la biología de la célula para hongos. Métodos en Biología Molecular 638. págs. 303-317. doi:10.1007/978-1-60761-611-5_23. ISBN978-1-60761-610-8. PMID20238279.editar
  10. ^ Blakeley, B. D.; Chapman, A. M.; McNaughton, B. R. (2012). "Montaje GFP de Split-superpositive es un método rápido, eficiente y robusto para la detección de las interacciones proteína – proteína in vivo". Biosistemas moleculares 8 (8): 2036-2040. doi:10.1039/c2mb25130b. PMID22692102.editar
  11. ^ Cabantous, S. P.; Nguyen, H. B.; Pedelacq, J. D.; Koraïchi, f el.; Chaudhary, A.; Ganguly, K.; Lockard, M. A.; Favre, G.; Terwilliger, T. C.; Waldo, G. S. (2013). "Un nuevo proteína-proteína interacción Sensor basado en división tripartita-GFP Asociación". Informes científicos 3:: 2854. doi:10.1038/srep02854. PMC3790201. PMID24092409.editar
  12. ^ Rossi, f el.; Charlton, A. C.; Blau, H. M. (1997). "Monitoreo de las interacciones de la proteína-proteína en células eucarióticas intactas por complementación de beta-galactosidasa". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 94 (16): 8405-8410. doi:10.1073/pnas.94.16.8405. PMC22934. PMID9237989.editar
  13. ^ Tchekanda, E; Sivanesan, D; Michnick, S. W. (2014). "Un reportero de infrarrojo para detectar la dinámica espacio-temporal de las interacciones proteína-proteína". Métodos de naturaleza 11 (6): 641-4. doi:10.1038/nmeth.2934. PMID24747815.editar
  14. ^ MA, Y. et al (2014) Quinasa de adhesión focal Split para sondar interacciones proteína – proteína. Revista de Ingeniería Bioquímica, doi:10.1016/j.bej.2014.06.022


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