Etiqueta de la bandera
Etiqueta de la bandera, o Octapéptido de la bandera, es un polipéptido etiqueta de la proteína pueden añadirse a una proteína utilizando ADN recombinante tecnología con motivo de la secuencia DYKXXD. Puede ser utilizado para cromatografía de afinidad, entonces se utiliza para separar recombinante, sobreexpresa la proteína de tipo salvaje proteína expresada por el organismo anfitrión. También puede ser utilizado en el aislamiento de complejos de la proteína con múltiples subunidades.
Una etiqueta de la bandera se puede utilizar en muchos diferentes ensayos de que requieren reconocimiento por parte de un anticuerpo. Si no hay ningún anticuerpo contra la proteína estudiada, añadiendo una etiqueta de bandera a esta proteína permite seguir la proteína con un anticuerpo contra la secuencia de la bandera. Ejemplos son los estudios de localización celular inmunofluorescencia o detección por SDS PAGE electroforesis de proteínas.
La secuencia del péptido de la etiqueta de bandera de la N-terminal a la terminal C es: DYKDDDDK (1012 Da). Puede ser utilizado en conjunción con otras etiquetas de afinidad, por ejemplo un (de la etiqueta del polyhistidineSu etiqueta), HA-tag o MYC-tag. Además, puede utilizarse en tándem, comúnmente el péptido 3xFLAG: DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK (con la etiqueta final de codificación de un sitio de la hendidura del enterokinase). Puede ser fusionada a la terminal C o N-terminal de una proteína. Algunos anticuerpos disponibles comercialmente (por ejemplo, M1/4E11) reconoce la epitopo sólo cuando está presente en el N-terminal. Sin embargo, otros anticuerpos disponibles (por ejemplo, M2) son insensibles a la posición.
El primer uso del epitope tagging fue descrito por Munro y Pelham en 1984.[1] La etiqueta de la bandera fue el segundo ejemplo de una etiqueta del epítopo completamente funcional para ser publicados en la literatura científica[2][3][4] y la etiqueta del epítopo único para ser patentado.[5][6] A diferencia de algunas otras etiquetas (por ejemplo, myc, HA), donde un anticuerpo monoclonal primero fue aislado contra una proteína existente, entonces el epitopo fue caracterizado y utilizado como una etiqueta, el epitopo de la bandera fue diseñado en primer lugar y luego monoclonals fueron levantados para reconocerlo. Estructura de la etiqueta de la bandera ha sido optimizado para compatibilidad con las proteínas que se adjunta, en que es más hidrofílico que otras etiquetas del epítopo común y por lo tanto menos propensos a desnaturalizar o inactivar proteínas a la cual se anexa. Además, N-terminal bandera etiquetas pueden extraerse fácilmente las proteínas una vez que han sido aislados, por el tratamiento con la proteasa específica (enterokinaseEnteropeptidasa).
El primer informe publicado de otro epitope tagging () métodoHA-tag)[7] apareció cerca de un año después de que el sistema de la bandera había sido enviado a laboratorios en todo el mundo para las pruebas de beta como un kit para producción de proteínas recombinantes.
Referencias
- ^ Munro, S; Pelham, h (1984). "Uso del péptido marcado para la detección de proteínas expresadas de clonado genes: dominios funcionales de la canceladura asignación de Drosophila hsp 70". El diario EMBO 3 (13): 3087 – 93. PMC557822. PMID6526011.
- ^ Hopp, Thomas P.; Prickett, Kathryn S.; Precio, Virginia L.; Libby, Randell T.; Marzo, Carl J.; Pat Cerretti, Douglas; Urdal, David L.; Conlon, Paul J. (1988). "Una polipéptido corto marcador secuencia útil para identificación de proteínas recombinantes y purificación". Bio/Technology 6 (10): 1204-10. doi:10.1038/nbt1088-1204.
- ^ Einhauer, A.; Jungbauer, A. (2001). «Péptido ™ de la bandera, una etiqueta de fusión versátil para la purificación de proteínas recombinantes». Diario de métodos bioquímicos y biofísicos 49 (1-3): 455-65. doi:10.1016/S0165-022 X (01) 00213-5. PMID11694294.
- ^ https://www-users.med.Cornell.edu/~jawagne/Flag-TAG.html[completa citación necesitó]
- ^ BANDERA es una marca registrada de Sigma-Aldrich Co. LLC
- ^ Hopp, T.P., et al (1987) síntesis de proteínas con un péptido de identificación (vectores). United States Patent 4.703.004.
- ^ Campo, J; Nikawa, J; Broek, D; MacDonald, B; Rodgers, L; Wilson, IA; Lerner, RA; Wigler, M (1988). "Purificación de un cyclase del adenylyl complejo de Saccharomyces cerevisiae por el uso de un método de adición del epítopo sensible al RAS". Biología molecular y celular 8 (5): 2159 – 65. PMC363397. PMID2455217.