Etiqueta final emparejado

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Etiquetas extremo apareado (PET) (a veces "Paired-End diTags" o simplemente "ditags") son secuencias cortas en los extremos 5' y 3' de un DNA fragmento que son bastante únicos que (teóricamente) existen juntos sólo una vez en un genoma, por lo tanto, a disposición de la secuencia de la DNA entre ellos sobre la búsqueda (si datos de la secuencia del genoma completo están disponibles) o sobre secuenciación más (ya que son únicos para servir como sitios de etiqueta cartilla de sitios de recocido). Etiquetas extremo apareado (PET) existen en las bibliotecas de PET con el ADN interviene ausente, es decir, un animal de compañía "representa" un fragmento más grande de la genómica o cDNA por que consiste en una secuencia corta de 5' linker, una etiqueta de secuencia corta de 5', una etiqueta de secuencia corta 3' y una secuencia corta de 3' linker. Fue demostrado expresiones que 13 pares de bases son suficientes para asignar etiquetas únicamente.[1] Sin embargo, secuencias más largas son más prácticas para el mapeo Lee únicamente. El Endonucleasas de (discutido más abajo) utilizado para producir animales dan más etiquetas (pares de bases de 18/20 y 25/27 pares de bases) pero secuencias de pares de bases de 50 – 100 sería óptimo para ambos mapas y rentabilidad.[1] Después de la extracción de las mascotas de muchos fragmentos de DNA, ellos se unen (concatenados) para la secuencia eficiente. En promedio, 20 – 30 etiquetas podrían ser ordenados con la Sanger método, que tiene un más largo leer longitud.[1] Puesto que las secuencias de la etiqueta son cortas, son ideales para animales individuales secuenciación de próxima generación tiene longitudes cortas de lectura y un mayor rendimiento. Las principales ventajas de la secuenciación de PET son fragmentos de su costo reducido por sólo secuencia corta, detección de variantes estructurales en el genoma y mayor especificidad cuando se alinean hacia el genoma comparado con etiquetas individuales, que consiste en solamente un extremo del fragmento de ADN.

Contenido

  • 1 Construcción de la biblioteca de PET
    • 1.1 Clonación en base
    • 1.2 Libre de clonación en
    • 1.3 Endonucleasas de
  • 2 Aplicaciones para mascotas
  • 3 Referencias

Construcción de la biblioteca de PET

Flujo de trabajo de clonación y clonación-libre basado en construcción de biblioteca de PET.

Bibliotecas del animal doméstico se prepararon normalmente en dos métodos generales: clonación y clonación-libre.

Clonación en base

Se clona fragmentos de ADN genómico o DNA complementaria (cDNA) de interés en vectores del plasmid. Los sitios de clonación están flanqueados con secuencias de adaptador que contienen sitios de restricción por endonucleasas (discutidos abajo). Inserciones se unen a los vectores del plasmid y vectores individuales son entonces transformado en E. coli lo que hace la biblioteca de PET. Secuencias del animal doméstico son obtenidas por purificación de plásmidos y digestión con endonucleasa específica dejando dos secuencias cortas en los extremos de los vectores. Condiciones intramolecular (diluido), vectores son volver a circular y ligadas, dejando sólo los ditags en el vector. Las secuencias únicas para el clon ahora están emparejadas juntos. Dependiendo de la secuenciación de próxima generación técnica, secuencias de animal doméstico pueden dejarse singulares, dimerized o concatenados en cadenas largas.[1]

Libre de clonación en

En lugar de clonación, adaptadores que contiene la secuencia de endonucleasa se unen a los extremos del ADN genómico fragmentado o cDNA. Las moléculas son luego uno circular y digestión con endonucleasa, liberando el PET.[1] Antes de la secuencia, estos animales se unen a los adaptadores a que PCR primers hibridan para amplificación. La ventaja de la clonación basado en construcción de la biblioteca es que mantiene los fragmentos o cDNA intacta para uso futuro. Sin embargo, el proceso de construcción es mucho más largo que el método de clonación-libre. Variaciones en la construcción de la biblioteca han sido producidas por secuenciación de próxima generación empresas adaptan sus tecnologías respectivas.[1]

Endonucleasas de

A diferencia de otras enzimas, MmeI (tipo IIS) y EcoP15I (tipo III) Endonucleasas de restricción corte aguas abajo de sus sitios de unión de destino. MmeI cortes 18/20 pares de bases corriente abajo [2] y EcoP15I cortes 25/27 pares de bases corriente abajo.[3] Como estas enzimas de restricción se unen a sus secuencias diana en los adaptadores, cortar y liberar vectores que contienen secuencias cortas del fragmento o cDNA ligada a ellos, produciendo animales de compañía.

Aplicaciones para mascotas

Ejemplo de detección de la PET de deleciones e inserciones.
Ejemplo de transcripción alternativa estructuras detectadas por la RNA-PET.
  1. ADN-PET:: Porque PET representan la conectividad entre las etiquetas, el uso de PET en volver a secuenciación de genoma tiene ventajas sobre el uso de solo Lee. Esta aplicación se llama secuencia final pares, conocida coloquialmente como secuencia de la escopeta de doble cañón. Anclaje uno la mitad de la pareja únicamente a un solo sitio del genoma permite mapeo de la otra mitad que es ambigua. Lecturas ambiguas son las que asignar a más de una sola ubicación. Este aumento de la eficiencia reduce los costes de secuenciación como estas secuencias ambiguas, o Lee, normalmente serían descartado. La conectividad de PET secuencias también permite la detección de variaciones estructurales: inserciones, eliminaciones, duplicaciones, inversiones de, translocaciones.[1][4] Durante la construcción de la biblioteca del animal doméstico, los fragmentos se pueden seleccionar para ser de un tamaño determinado. Después de la asignación, las secuencias de PET así se esperan que sean consistentemente una distancia determinada unos de otros. Una discrepancia de esta distancia indica una variación estructural entre las secuencias de PET. Por ejemplo (figura de la derecha): una canceladura en el genoma secuenciado tendrá lee el mapa más lejos de lo esperado en el genoma de referencia como el genoma de referencia tendrá un segmento de ADN que no está presente en el genoma secuenciado.
  2. ChIP-PET:: El uso combinado de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el PET se utiliza para detectar regiones de ADN vinculados por una proteína de interés. ChIP-PET tiene la ventaja sobre la secuencia leer sola al reducir la ambigüedad de las lecturas generadas. La ventaja sobre (hibridación) chipChIP Chip) es que matrices de hibridación mosaico no tiene la sensibilidad estadística que lee de la secuencia. Sin embargo, ChIP-PET, ChIP-Seq[5][6][7] y ChIP chip[8] han sido altamente exitosos.[1]
  3. ChIA-PET:: La aplicación de la secuencia de la PET en el análisis de la interacción de la cromatina. Es una estrategia de todo el genoma para hallar de novo interacciones de largo alcance entre elementos de la DNA limitados por factores proteicos.[9] La primera mascota de ChIA fue desarrollada por Fullwood et al.. (2009)[9] para generar un mapa de las interacciones entre cromatina obligado por α del receptor de estrógeno (ER-α) en la mama tratada con estrógenos adenocarcinoma células.[9] ChIA-PET es una forma imparcial para analizar las interacciones y las estructuras de orden superior cromatina porque puede detectar interacciones entre los elementos de ADN desconocidos. En contraste, C 3 y C 4 métodos se utilizan para detectar las interacciones que implican una región objetivo específico en el genoma. ChIA-PET es similar a encontrar genes de fusión a través de RNA-PET en las etiquetas pareadas mapa a diferentes regiones en el genoma.[1] Sin embargo, ChIA PET involucra trompas artificiales entre diferentes fragmentos de ADN situados en diferentes regiones genómicas, en lugar de fusión natural entre dos regiones genómicas como RNA-PET.
  4. ARN-PET:: Esta aplicación se utiliza para el estudio de la transcriptoma:: transcripciones, gene estructuras y expresiones del gene.[1][10] La biblioteca de PET se genera usando cDNAs de longitud completa, por lo que representan los ditags 5' tope y 3' polyA cola firmas de certificados individuales. Por lo tanto, es especialmente útil para delimitar los límites de las unidades de transcripción RNA-PET. Esto le ayudará a identificar los sitios de inicio de transcripción alternativa y poliadenilación sitios de genes.[1] RNA-PET también podría ser utilizado para detectar genes de fusión y trans-splicing, pero más experiencia es necesaria para distinguir entre ellos.[11] Otros métodos de búsqueda de los límites de las transcripciones incluyen las estrategias de la etiqueta solo JAULA DE, SABIOy el más reciente SuperSAGE, con la jaula y 5' SAGE definiendo la transcripción Inicio sitios y el 3' SAGE definiendo el poliadenilación sitios.[1] Las ventajas de la secuenciación del PET sobre estos métodos son que PET identificar ambos extremos de las transcripciones y, al mismo tiempo, proporcionar más especificidad al hacia el genoma. Secuenciación de los cDNAs puede revelar las estructuras de las transcripciones en gran detalle, pero este enfoque es mucho más caro que la secuencia de RNA-PET, especialmente para caracterizar el conjunto transcriptoma.[10] La limitación principal de RNA-PET es la falta de información sobre la organización de los internos exones de las transcripciones. Por lo tanto, no es conveniente para la detección de RNA-PET splicing alternativo. Además, si el clonación procedimiento se utiliza construir la biblioteca de cDNA antes de generar los animales domésticos, cDNAs que son difíciles de clonar (por ejemplo, debido a las largas transcripciones) tendría cobertura inferior.[10] Del mismo modo, las transcripciones (o transcripción isoformas) con nivel bajo de expresión sería probablemente insuficientemente representados así.

Referencias

  1. ^ a b c d e f g h i j k l Fullwood MJ, Wei CL, Liu ET, Ruan Y. 2009. Secuenciación de ADN de próxima generación de etiquetas extremo apareado (PET) para el análisis de transcriptoma y genoma. Investigación del genoma. 19:521 – 532. PMID 19339662
  2. ^ Morgan RD, Bhatia TK, L Lovasco, Davis TB. 2008. MmeI: Un tipo II modificación restricción sistema mínimo que sólo se modifica una sola hebra de ADN para la protección del host. Ácidos nucleic res. 36:6558 – 6570.
  3. ^ H de Matsumura, Reich S, Ito A, Saitoh H, S Kamoun, invierno P, Kahl G, Reuter M, Kruger DH, Terauchi R. 2003. Análisis de expresión génica de las interacciones huésped-patógeno de planta por SuperSAGE. 100:15718 proc. nacional Acad. SCI. – 15723.
  4. ^ McKernan et al. 2009. Variación estructural y la secuencia en un genoma humano descubierto por secuenciación de ligadura corta lectura, tratamiento masivo en paralelo mediante la codificación de la base de dos. Investigación del genoma. 19:1527-1541.
  5. ^ Barski A, de Cuddapa S, de Cui K, de TY de Roh, de Schones, de Z Wang, de Wei G, de Chepelev I, Zhao K. 2007. Perfiles de alta resolución de metilaciones de las histonas en el genoma humano. Célula. 129:823 – 837.
  6. ^ Johnson DS, A Mortazavi, Myers RM, sería B. 2007. Asignación de Genomewide de interacciones proteína-DNA in vivo. Ciencia. 316:1497-1502.
  7. ^ Chen X et al. 2008. Integración de vías de señalización externas con el core network transcripcional en células madre embrionarias. 133 de la célula: 1106-1117.
  8. ^ Wu J, Smith LT, Plass C, Huang TH. 2006. viruta viene de edad para el análisis funcional del genoma. Cáncer res 66(14): 6899-902
  9. ^ a b c Fullwood MJ, Liu MH, Pan YF et al., 2009. Un interactoma estrógeno-receptor-alpha-limite humano cromatina. Naturaleza. 462: 58-64.
  10. ^ a b c NG, P, CL, Wei canta WK et al., 2005. Análisis para la anotación de caracterización y genoma transcriptoma del gene identificación firma (SIG). Métodos de NAT. 2: 105-111.
  11. ^ Y de Ruan, Ooi HS, Choo SW et al 2007. Transcripciones de la fusión y transcrito retrotransposed loci descubiertos a través del análisis de transcriptoma completo usando Paired-End diTags (animales domésticos). Res de genoma 17:828 – 838.

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