In situ hibridación

RNA in situ hibridación - KRT5 y gen housekeeping en sección de tejido de melanoma humano FFPE - visualizado bajo el microscopio de campo luminoso y fluorescencia

MULTIPLEX visualización de RNA en las células usando ensayos de pescado ViewRNA

In situ hibridación de tipo salvaje Drosophila embriones en diferentes etapas de desarrollo para el RNA de un gen llaman jorobado.

In situ hibridación (ISH) es un tipo de hibridación que utiliza un etiquetado ADN complementario, RNA o modificación de ácidos nucleicos del filamento (es decir, punta de prueba) para localizar una secuencia específica de DNA o RNA en una porción o sección de tejido (in situ), o, si el tejido es lo suficientemente pequeño (por ejemplo, plantar semillas, Drosophila los embriones), en el tejido entero (todo montaje ISH), en las células y en la circulación de las células tumorales (CTC). Esto es distinto de Immunohistochemistry, que generalmente localiza las proteínas en secciones del tejido fino.

Hibridación in situ es una técnica poderosa para la identificación de especies de mRNA específicos dentro de células individuales en secciones del tejido, proporcionando penetraciones en los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, el hibridación in situ requiere que muchos pasos con optimización exacta para cada tejido examinado y para cada sonda utilizada. Para preservar la meta ARNm dentro de tejidos, a menudo es necesario utilizar fijadores de reticulación (tales como formaldehído).

Hibridación in situ se utiliza para revelar la localización de secuencias específicas de ácido nucleico en los cromosomas o en los tejidos, un paso crucial para la comprensión de la organización, regulación y función de los genes. Las principales técnicas actualmente en uso incluyen: sondas de hibridación in situ de mRNA con oligonucleótidos y RNA (marcado con radio y etiquetada hapteno;) Análisis con luz y microscopios; todo Monte hibridación in situ; doble detección de RNAs y RNA y proteínas; y la hibridación in situ fluorescente para detectar secuencias cromosómicas. DNA ISH puede utilizarse para determinar la estructura de los cromosomas. DNA fluorescente ISH (Pescado) puede utilizarse por ejemplo, en diagnóstico médico para evaluar integridad cromosómica. ISH DE ARN (ARN in situ hibridación) se utiliza para medir y localizar RNAs (mRNAs, lncRNAs y miRNAs) dentro de las secciones de tejido, células, montajes de todo, y tumor de circulación las células (CTC). In situ hibridación fue inventado por Joseph G. Gall.

Proceso

Para la hibridación histoquímica de la, muestra las células y los tejidos se tratan generalmente para fijar las transcripciones de destino y aumentar el acceso de la sonda. Como se señaló anteriormente, la sonda es una etiqueta ADN complementario o ahora más frecuentemente, una complementaria RNA (riboprobe). La sonda cruza por hibridación a la secuencia Diana a temperatura elevada, y entonces la sonda excesiva se lava lejos (después de la hidrólisis previa usando Rnasa en el caso de la sonda de RNA de unhybridized, exceso). Parámetros de solución como la concentración de sal o detergente de temperatura, pueden ser manipulados para quitar cualquier interacción no idénticos (es decir, sólo la secuencia exacta acerca de los partidos seguirá siendo encuadernado). Entonces, la sonda que fue etiquetada con cualquier radio-, bases fluorescentes o antígeno marcado (por ejemplo, digoxigenina) es localizada y cuantificar en el tejido mediante autorradiografía, Microscopía de fluorescencia, o Immunohistochemistry, respectivamente. ISH también puede utilizar dos o más sondas, marcadas con radioactividad o las etiquetas no radiactivo para detectar simultáneamente dos o más expedientes.

Una tecnología alternativa, Análisis de ADN ramificado, se puede utilizar para RNA (mRNA lncRNA y miRNA) in situ ensayos de hibridación con sensibilidad a la sola molécula sin el uso de la radiactividad. Este enfoque (por ejemplo, ensayos ViewRNA) puede utilizarse para visualizar hasta cuatro objetivos en un ensayo, y utiliza sonda patentado diseño y bDNA amplificación de la señal para generar señales sensibles y específicas. Muestras (células, tejidos y CTC) se fija y luego tratadas para permitir la accesibilidad del destino de RNA (RNA sin enmascaramiento). Sondas específicas de objetivo hibridan a cada destino de RNA. Amplificación de la señal posterior se basa en la hibridación específico de sondas adyacentes (individuales oligonucleótidos [oligos] se unen lado a lado en objetivos de RNA). Un sondeo específico del destino típico contendrá 40 oligonucleótidos, resultando en 20 pares de oligo que se unen lado a lado en el objetivo para la detección de mRNA y lncRNA y 2 oligos o un solo par para la detección de miRNA. Amplificación de la señal se consigue mediante una serie de pasos secuenciales de la hibridación. Una molécula de preamplificador cruza por hibridación a cada par de oligo en el RNA específico del destino, entonces múltiples moléculas de amplificador hibridan a cada amplificador de potencia. A continuación, varios sonda etiqueta hibridan oligonucleótidos (conjugados a fosfatasa alcalina o directamente a fluoróforos) para cada molécula del amplificador. Una estructura de amplificación de señal completamente montado "Árbol" tiene 400 sitios de Unión para las sondas de etiqueta. Cuando todos los sondeos específicos objetivo enlazar a la transcripción de mRNA de la blanco, una amplificación de la señal de 8.000 veces ocurre para una transcripción. Sistemas de amplificación de señal independientes pero compatibles permiten los ensayos multiplex. La señal se puede visualizar mediante un microscopio de fluorescencia o trasmitida.

Pasos básicos para sondas marcadas con digoxigenina

1. permeabilización de células con proteinasa K para abrir las membranas celulares (alrededor de 25 minutos, no es necesarios para las secciones de tejido o de algunos embriones de etapa temprana)
2. atascamiento de mRNAs con sonda de RNA marcado (generalmente durante la noche)
3. Unión de anticuerpo fosfatasa a sonda de RNA (algunas horas)
4. la coloración del anticuerpo (por ejemplo, con fosfatasa alcalina)

El protocolo toma alrededor de 2 – 3 días y toma algún tiempo para configurar. Algunas compañías venden robots para automatizar el proceso (por ejemplo, Intavis InsituPro VSi). Como resultado, se han realizado exámenes a gran escala en laboratorios a miles de genes. Los resultados generalmente pueden acceder a través de sitios web (véase los Acoplamientos externos).

Véase también

• Cromogénico in situ hibridación (hybridization, CISH)

Referencias

1. Jin, L; Lloyd, RV (1997). "Hibridación In situ: métodos y aplicaciones". Revista de análisis de laboratorio clínico 11 (1): 2 – 9. doi:10.1002 / (SICI) 1098-2825 (1997) 11:1 < 2::AID-JCLA2 > 3.0.CO;2-F. PMID9021518.
2. Histoquímica del hibridación in situ comprensiva y anotada
3. Secuenciación del RNA de las células tumorales circulantes pancreático implica WNT de señalización en metástasis
4. El transcriptoma Local en el Neuropil sináptico revelado por secuenciación profunda y proyección de imagen de alta resolución

Enlaces externos

• Hibridación in Situ en las Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina Encabezamientos de temas médicos (MeSH)
• En Situ hibridación de RNA y miRNA sondas a los tejidos, células y CTC
• Whole-Mount hibridación In Situ de RNA puntas de prueba a los tejidos vegetales
• Preparación de complejos conjuntos de ADN sonda para pesca 3D con hasta seis diferentes fluorocromos
• Transcripción de hibridación In Situ de embriones Whole-Mount para el análisis del fenotipo de Drosophila RNAi-tratados

• bases de datos in situ:
  • Fantasma, intestinalis C. factores de transcripción
  • Búsqueda de expresión de gen de pez cebra
  • Expresión de genes de ratón MGI GXD
  • [1]

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