Huella de ADN

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Flujo de trabajo de ADN huella

DNA huella es un método de investigar la especificidad de secuencia de ADN proteínas en vitro. Esta técnica puede utilizarse para el estudio de las interacciones DNA proteína tanto fuera como dentro de las células.

La regulación de la transcripción se ha estudiado extensivamente y sin embargo todavía hay mucho que no se conoce. Factores de transcripción y proteínas asociadas que unen promotores, potenciadores de, o silenciadores para manejar o reprimir la transcripción son fundamentales para entender la regulación única del individuo genes dentro de la genoma. Técnicas como huella de ADN ayudará a dilucidar que las proteínas se unen a estas regiones de ADN y desentrañar las complejidades del control transcripcional.

Contenido

  • 1 Historia
  • 2 Método
    • 2.1 Etiquetado
    • 2.2 Agente de la hendidura
  • 3 Aplicaciones avanzadas
    • 3.1 En vivo huella de
    • 3.2 Footprinting cuantitativo
    • 3.3 Detección por electroforesis capilar
  • 4 Análisis del genoma
  • 5 Véase también
  • 6 Referencias
  • 7 Enlaces externos

Historia

En 1978, David Galas y Albert Schmitz desarrollaron la técnica de la huella de ADN para estudiar la especificidad del atascamiento de la proteína del represor lac. Era originalmente una modificación de la técnica de secuenciación química de Maxam-Gilbert.[1]

Método

La aplicación más simple de esta técnica es evaluar si una determinada proteína se une a una región de interés dentro de una molécula de ADN.[2] Reacción en cadena de polimerasa (PCR) amplificar y etiqueta de región de interés que contiene un potencial sitio de unión a proteínas, amplicon está idealmente entre 50 y 200 pares de bases en longitud. Añadir la proteína de interés a una porción de la DNA de la plantilla marcada; una porción debe permanecer separada sin la proteína, para posterior comparación. Agregar a un agente de la hendidura a ambas porciones de la plantilla de la DNA. El agente de la hendidura es un producto químico o enzima que corta al azar localizaciones en una manera independiente de la secuencia. La reacción debe ocurrir justo lo suficiente reducir cada molécula de ADN en una única ubicación. Una proteína que se une específicamente a una región dentro de la plantilla de la DNA protegerá el ADN es obligado desde el agente de la hendidura. Ejecutar ambas muestras de lado a lado en un poliacrilamida electroforesis en gel de. La parte de la plantilla de ADN sin proteínas se cortarán al azar localizaciones, y así cuando se ejecuta en un gel, producirá una distribución escalariforme. La plantilla de la DNA con la proteína resultará en la distribución de la escalera con un descanso en él, la "huella", donde el ADN se ha protegido desde el agente de la hendidura. Nota: Química de Maxam-Gilbert Secuencia de la DNA se puede ejecutar junto con las muestras en el gel de poliacrilamida para permitir la predicción de la localización exacta del sitio de unión al ligando.

Etiquetado

La plantilla de la DNA puede etiquetarse en el 3' o 5' el extremo, dependiendo de la ubicación de los sitios de enlace. Las etiquetas que se pueden utilizar son: radioactividad y fluorescencia. Radiactividad se ha utilizado tradicionalmente para identificar fragmentos de ADN para el análisis de la huella, como el método fue desarrollado originalmente de la técnica de secuenciación química de Maxam-Gilbert. Etiquetado radiactivo es muy sensible y es óptimo para la visualización de pequeñas cantidades de ADN. Fluorescencia es un avance deseable debido a los peligros del uso de radio-productos químicos. Sin embargo, ha sido más difícil optimizar porque no siempre es lo suficientemente sensible para detectar las concentraciones bajas de los filamentos de la DNA objetivo utilizados en experimentos de huella de ADN. Geles de secuenciación electroforética o electroforesis capilar han tenido éxito en el análisis de huella de fragmentos marcados fluorescentes.[2]

Agente de la hendidura

Puede elegir una variedad de agentes de la división. Idealmente un agente deseable es aquel que es la secuencia de neutro, fácil de usar y es fácil de controlar. Por desgracia ninguno disponible satisfacer todas estas todas estas normas, por lo que un agente apropiado puede ser elegido, según la secuencia de la DNA y el ligando de interés. Los siguientes agentes de escote se describen en detalle: DNasa I es una gran proteína que funciona como una doble cadena endonucleasa. Se une al surco menor del ADN y hiende el esqueleto fosfodiéster. Es un agente de buen escote para huella porque su tamaño lo hace fácilmente físicamente impedido. Por lo tanto es más probable que su acción está bloqueada por una proteína encuadernada en una secuencia de ADN. Además, la DNasa I enzima se controla fácilmente mediante la adición de EDTA para detener la reacción. Sin embargo hay algunas limitaciones en el uso de DNasa I. La enzima no corta la DNA aleatoriamente; su actividad se ve afectada por la secuencia y estructura de ADN local y por lo tanto resulta en una escalera irregular. Esto puede limitar la precisión de la predicción del sitio de unión de una proteína en la molécula de ADN.[2][3] Radicales hidroxilo creado a partir de la Reacción de Fenton, que consiste en la reducción de Fe2+ con H2O2 para formar moléculas de hidroxilo libre. Estas moléculas del oxhidrilo reaccionan con la espina dorsal de la DNA, dando por resultado una rotura. Debido a su pequeño tamaño, la huella de ADN resultante tiene alta resolución. A diferencia de la DNasa I no tienen ninguna dependencia de la secuencia y dar lugar a un mucho más uniformemente distribuida escalera. El aspecto negativo del uso de radicales hidroxilo es que son más lentos a utilizar, debido a un tiempo más lento de reacción y la digestión.[4] Irradiación ultravioleta puede utilizarse para excitar los ácidos nucleicos y crear photoreactions, que se traduce en bases dañadas en el DNA del filamento. Photoreactions puede incluir: solo filamento se rompe, las interacciones entre o dentro de filamentos de la DNA, reacciones con solventes o vínculos cruzados con las proteínas. El flujo de trabajo para este método tiene un paso adicional, una vez su protegido y desprotegido ADN han sido tratados, extensión posterior imprimación de los productos troceados. La extensión terminará al llegar a una base dañada, y así cuando los productos PCR se ejecutan side-by-side en un gel; la muestra protegida mostrará una banda adicional donde el ADN fue reticulado con una proteína encuadernada. Ventajas del uso de UV están que reacciona muy rápidamente y por lo tanto puede capturar interacciones que son sólo momentáneas. Además se puede aplicar a en vivo los experimentos, porque los rayos UV puede penetrar las membranas celulares. Una desventaja es que el gel puede ser difícil de interpretar, como la proteína encuadernada no protege el ADN, simplemente altera los photoreactions en las proximidades.[5]

Aplicaciones avanzadas

En vivo huella de

En vivo huella es una técnica utilizada para analizar las interacciones proteína-ADN que se producen en una célula en un momento dado. Puede ser utilizado como un agente de la hendidura si la membrana celular ha sido permeabilized de DNasa. Sin embargo el agente más común de hendidura utilizado es la radiación ultravioleta porque penetra la membrana de la célula sin alterar el estado de la célula y por lo tanto puede capturar interacciones que son sensibles a los cambios celulares. Una vez que el ADN ha sido hendido o dañados por UV, las células pueden ser lisadas y ADN purificado para el análisis de una región de interés. PCR ligadura-mediado es un método alternativo para la huella en vivo. Una vez que un agente de la hendidura se ha utilizado en la DNA genomic, dando por resultado la hebra se rompe, y se aísla el ADN, un enlazador es añadido en los puntos de rotura. Una región de interés se amplifica entre el vinculador y una cartilla gene-específica y cuando se ejecuta en un gel de poliacrilamida, tendrá una huella donde una proteína estuvo limitada.[6] En vivo footprinting combinado con inmunoprecipitación puede utilizarse para evaluar la especificidad de la proteína en muchas localizaciones por todo el genoma. El ADN unido a una proteína de interés puede ser immunoprecipitated con un anticuerpo a la proteína de, y entonces enlace de región específica puede ser evaluada mediante la técnica de la huella de ADN.[7]

Footprinting cuantitativo

La técnica de footprinting de la DNA puede modificarse para evaluar la fuerza de una proteína a una región del ADN. Utilizando diversas concentraciones de la proteína para el experimento footprinting, puede observarse la aparición de la huella como las concentraciones aumentan y entonces se pueden calcular las proteínas vinculantes afinidad.[2]

Detección por electroforesis capilar

Para adaptar la técnica footprinting de métodos de detección actualizado, los fragmentos de ADN marcados son detectados por un aparato de electroforesis capilar en lugar de ser correr en un gel de poliacrilamida. Si el fragmento de ADN a analizar se produce por reacción en cadena de polimerasa (PCR), es es sencillo a la par una molécula fluorescente como carboxyfluorescein (FAM) a los iniciadores. Esta manera, los fragmentos producidos por la digestión DNaseI contendrán FAM y serán detectables por la máquina de electroforesis capilar. Normalmente, carboxytetramethyl-rodamina (ROX)-estándares del tamaño etiquetado también se agregan a la mezcla de los fragmentos a analizar. Sitios de transcripción factores han sido identificados con éxito esta forma de Unión.[8]

Análisis del genoma

Secuenciación de próxima generación ha permitido un acercamiento del genoma identificar huellas de ADN. Análisis de la cromatina abierta como DNasa-Seq[9] y FAIRE-Seq[10] han demostrado proporcionar un paisaje regulatorio robusto para muchos tipos de células.[11] Sin embargo, estos ensayos requieren algunos análisis bioinformática aguas abajo con el fin de proporcionar huellas de ADN del genoma. Las herramientas computacionales propusieron se pueden categorizar en dos clases: enfoques basados en la segmentación y centrada en el sitio.

Métodos basados en la segmentación se basan en la aplicación de Modelos ocultos de Markov o métodos de ventana deslizante para segmentar el genoma en abierto/cerraron región de cromatina. Ejemplos de tales métodos son: Consejo,[12] Método de Boyle[13] y método de Neph.[14] Métodos centrados en el sitio, por el contrario, encuentran huellas dados el perfil de la cromatina abierta alrededor de sitios de Unión predijo Adorno, es decir, las regiones reguladoras predichas utilizando información de la secuencia de ADN-proteína (codificada en estructuras tales como Matriz de peso de posición). Ejemplos de estos métodos son ciempiés[15] y el método de la Partida de Cuellar.[16]

Véase también

  • Huella de DNasa
  • Huella de proteínas
  • Ensayo de Toeprinting

Referencias

  1. ^ Galas, D; Schmitz, (1978). "Huella de la DNasa: un método simple para la detección de la especificidad de Unión proteína-DNA". Investigación de ácidos nucleicos 5 (9): 3157 – 70. doi:10.1093/Nar/5.9.3157. PMC342238. PMID212715.
  2. ^ a b c d Hampshire, A; Rusling, D; Cabeza de Broughton, V; Fox, K (2007). "Footprinting: un método para determinar la selectividad de la secuencia, la afinidad y la cinética de ligandos de unión al ADN". Métodos 42:: 128-140. doi:10.1016/j.ymeth.2007.01.002.
  3. ^ DNasa B LeBlanc y T. Moss (2001) mi huella. Métodos en Biología Molecular. 148: 31 – 8.
  4. ^ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L y Heumann H. (2001) hidroxilo huella radical. Métodos en Biología Molecular. 148: 49-61.
  5. ^ Huella de Geiselmann J y láser ultravioleta de Boccard F. (2001). Métodos en Biología Molecular. 148:161-73.
  6. ^ Dai S, Chen H, Chang C, A Riggs, Flanagan S. (2000) PCR ligadura-mediado de footprinting in vivo cuantitativa. Biotecnología de la naturaleza. 18:1108-1111.
  7. ^ Zaret, K (1997). "Editorial". Métodos 11:: 149 – 150. doi:10.1006/Meth.1996.0400.
  8. ^ Kovács, k. A.; Steinmann, M.; Magistretti, p. J.; Halfon, O.; Cardinaux, J.-R.:C/EBPbeta parejas señalización a la expresión del gen del precursor sustancia P en las neuronas estriatales de dopamina. J. Neurochem. 2006, 98(5), 1390.
  9. ^ Canción, L; Crawford, GE (Feb de 2010). "DNasa-seq: una técnica de alta resolución para el mapeo de elementos reguladores de genes activos en el genoma de las células mamíferas.". Protocolos de Cold Spring Harbor 2:: pdb.prot5384+. doi:10.1101/PDB.prot5384. PMC3627383. PMID20150147.
  10. ^ Giresi, PG; Kim, J; McDaniell, RM; Iyer, VR; Lieb, JD (Jun de 2007). "FAIRE (aislamiento Formaldehyde-Assisted de los elementos reglamentarios) aísla elementos activos reguladores de cromatina humana.". Investigación del genoma 17 (6): 877 – 85. doi:10.1101/gr.5533506. PMC1891346. PMID17179217.
  11. ^ Thurman, RE et al (septiembre 2012). "El paisaje de la cromatina accesible del genoma humano.". Naturaleza 489 (7414): 75 – 82. doi:10.1038/nature11232. PMC3721348. PMID22955617.
  12. ^ Gusmao, por ejemplo; Dieterich, C; Zenke, M; Costa, IG (agosto de 2014). "Detección del Factor de transcripción activa sitios con la combinación de la hipersensibilidad de la DNasa y modificaciones de las histonas de Unión". Bioinformática 30 (22): 3143 – 51. doi:10.1093/Bioinformatics/btu519. PMID25086003.
  13. ^ Boyle, AP et al., (Mar de 2011). "Alta resolución genoma footprinting in vivo de la transcripción diverso factores en células humanas.". Investigación del genoma 21 (3): 456 – 464. doi:10.1101/gr.112656.110. PMC3044859. PMID21106903.
  14. ^ Neph, S et al (septiembre 2012). "Un expansivo humano regulador léxico codificado en huellas del factor de transcripción.". Naturaleza 489 (7414): 83-90. doi:10.1038/nature11212. PMID22955618.
  15. ^ Piqué-Regi, R et al (Mar de 2011). "Inferencia exacta de unión de factor de transcripción de datos de ADN secuencia y cromatina accesibilidad.". Investigación del genoma 21 (3): 447-455. doi:10.1101/gr.112623.110. PMC3044858. PMID21106904.
  16. ^ Cuellar-Partida, G et al (enero de 2012). "Epigenéticos reincidentes para la identificación de sitios de unión del factor de transcripción activa.". Bioinformática 28 (1): 56 – 62. doi:10.1093/Bioinformatics/btr614. PMC3244768. PMID22072382.

Enlaces externos

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