Immunohistochemistry

Tajada de cerebro de ratón tinción por inmunohistoquímica.

Immunohistochemistry o IHC se refiere al proceso de detección de antígenos (p. ej., proteínas) en las células de una sección de tejido, explotando el principio de anticuerpos atar específicamente a los antígenos en tejidos biológicos. IHC toma su nombre de las raíces "inmuno", en referencia a anticuerpos utilizados en el procedimiento y "histo", significando tejido (Comparar con el inmunocitoquímica). El procedimiento fue conceptualizado y primero implementado por el Dr.. Albert Coons en 1941.

La coloración de Immunohistochemical es ampliamente utilizada en el diagnóstico de las células anormales como los tumores cancerosos. Marcadores moleculares específicos son característicos de determinados eventos celulares tales como proliferación o (muerte) celularapoptosis). IHC es también ampliamente utilizado en investigación básica para entender la distribución y localización de proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico y biomarcadores.

Visualizando una interacción antígeno-anticuerpo se puede lograr de varias formas. En el caso más común, un anticuerpo está conjugado con una enzima, tales como peroxidasa de, que puede catalizar una reacción de producción de color (véase tinción de inmunoperoxidasa). Alternativamente, el anticuerpo puede también ser etiquetado a un fluoróforo, tales como con fluoresceína o rodamina (véase inmunofluorescencia).

Preparación de la muestra

Preparación de la muestra es fundamental para mantener la morfología de la célula, arquitectura del tejido y la antigenicidad de los epitopos de destino. Esto requiere la colección de tejido adecuada, fijación y seccionamiento. Una solución de paraformaldehido a menudo se utiliza para fijar el tejido, pero se pueden utilizar otros métodos. El tejido puede ser entonces en rodajas o entero usado, depende de la finalidad del experimento o el propio tejido. Antes de seccionar, la muestra de tejido puede ser embebida en un medio, como cera de parafina o cryomedia. Secciones pueden ser en rodajas en una variedad de instrumentos, más comúnmente un para Microtomo o criostatoy están en un rango de 4-40 μm. Las rebanadas entonces montan en diapositivas, deshidratados con lavados de alcohol de aumento de las concentraciones (por ejemplo, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) y limpiado con un detergente como xileno antes de que se va a examinar bajo un microscopio.

El dependiente en el método de fijación y conservación de tejido, la muestra puede requerir pasos adicionales a disposición de los epítopos de unión de anticuerpos, incluyendo parafina y recuperación de antígeno. Para tejidos parafina-encajado formalina-fijos, recuperación de antígeno es a menudo necesario y trata previamente las secciones con calor o proteasa. Estos pasos pueden hacer la diferencia entre los antígenos blanco manchas o manchas no.

Depende del tipo de tejido y el método de detección de antígeno, endógeno biotina o enzimas deba ser bloqueada o apagada, respectivamente, antes de la tinción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos muestran avidez preferencial de epitopos específicos, puede parcialmente o débil atan a sitios en proteínas inespecíficas (también llamados sitios reactivos) que son similares a los sitios de Unión cognada en el antígeno Diana. Una gran cantidad de fijación no específica causa fondo alta coloración que máscara de la detección del antígeno blanco. Para reducir manchas en IHC, Fondo CORTE PENAL INTERNACIONAL y otros métodos de immunostaining, las muestras se incuban con un tampón que bloquea los sitios reactivos que de lo contrario pueden obligar a los anticuerpos primarios o secundarios. Común bloqueo almacenadores intermediarios incluyen normal del suero, leche en polvo descremada, BSA, o gelatina. Tampones bloqueo comerciales con formulaciones propietarias están disponibles para una mayor eficiencia. Métodos para eliminar la coloración de fondo incluyen la dilución de los anticuerpos primarios o secundarios, cambiando la hora o la temperatura de incubación y usando un sistema de detección diferentes o diferente anticuerpo primario. Control de calidad debe incluir, como mínimo, un tejido que expresan el antígeno como control positivo y negativos controles de tejido sabe que no expresan el antígeno, así como el tejido de la prueba de sondeo de la misma manera con la omisión del anticuerpo primario (o mejor, de absorción del anticuerpo primario).

Etiquetado de la muestra

Tipos de anticuerpos

Los anticuerpos utilizados para la detección específica pueden ser policlonal o monoclonal. Anticuerpos policlonales se hacen inyectando animales con la proteína de interés, o un fragmento del péptido y, después de una respuesta inmune secundaria es estimulada, aislar los anticuerpos del suero entero. Así, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen varios epitopos. Los anticuerpos monoclonales muestran especificidad por un único epitopo.

Estrategias de detección de IHC, anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios. Anticuerpos primarios se levantan contra un antígeno de interés y son típicamente no conjugados (sin etiqueta), mientras que los anticuerpos secundarios se plantean contra las inmunoglobulinas de la especie del anticuerpo primario. El anticuerpo secundario es generalmente conjugado a una molécula de vinculador, tales como biotina, que entonces recluta las moléculas reporter, o el anticuerpo secundario sí mismo está directamente enlazado a la molécula reporter.

Reporteros IHC

Las moléculas Reporter varían según la naturaleza del método de detección, siendo el más popular cromogénicos y fluorescencia detección mediada por una enzima o un fluoróforo, respectivamente. Con reporteros cromogénicos, una etiqueta de enzima se reaccionó con un sustrato para producir un producto de color muy intenso que puede analizarse con un microscopio de luz ordinario. Mientras que la lista de sustratos enzimáticos es extensa, fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de rábano (HRP) son dos enzimas utilizados más ampliamente como etiquetas para detección de proteínas. Una matriz de cromógenos, fluorógenos y sustratos quimioluminiscente es disponible para su uso con cualquier enzima, incluyendo DAB o BCIP/NBT, que producen un marrón o púrpura tinción, respectivamente, donde las enzimas están limitadas.

Reacción con el lenguado puede mejorarse usando níquel, produce una coloración púrpura/negro profundo. Reporteros fluorescentes son moléculas pequeñas, orgánicas utilizadas para la detección de IHC y tradicionalmente incluyen FITC, TRITC y AMCA, mientras que los derivados comerciales, incluyendo la Alexa Fluors y Dylight Fluors, muestran mayor rendimiento similar pero varían en precio. Para métodos de detección cromogénica y fluorescente, análisis densitométrico de la señal pueden proporcionar semi - y completamente cuantitativos datos, respectivamente, para correlacionar el nivel de señal de reportera a nivel de expresión de la proteína o de localización.

El método directo de tinción inmunohistoquímica utiliza un anticuerpo etiquetado, que se une directamente al antígeno que mancharon para el.

El método indirecto de inmunohistoquímica tinción utiliza un anticuerpo contra el antígeno siendo sondeado para y un segundo, etiquetados, anticuerpo contra el primero.

Métodos de detección de antígeno de destino

El método directo es un paso la coloración método y consiste en una etiqueta anticuerpo (p. ej. FITC-Conjugado antisuero) reacciona directamente con el antígeno en las secciones de tejido. Mientras que esta técnica utiliza sólo uno anticuerpo y por lo tanto es simple y rápida, la sensibilidad es baja debido a la poca amplificación de la señal, a diferencia de enfoques indirectos. Sin embargo, esta estrategia se utiliza con menos frecuencia que sus contrapartes de múltiples fases.

El método indirecto consiste en un anticuerpo primario sin etiqueta (primera capa) que se une al objetivo antígeno en el tejido y una marcada anticuerpo secundario (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario. Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo secundario debe elevarse contra la De igG de la especie animal en que se ha planteado el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de la señal debido a la Unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario si el anticuerpo secundario es conjugado con el fluorescente o enzima reportero.

Amplificación posterior puede lograrse si el anticuerpo secundario es conjugado a varios biotina moléculas, que pueden reclutar complejos de avidina-, estreptavidina- o NeutrAvidin proteína-dependiente de la enzima. La diferencia entre estas tres proteínas de unión a biotina es su afinidad individual a los objetivos de tejido endógeno conduce a atascamiento no específico y fondo alta; el ranking de estas proteínas basada en sus afinidades de Unión inespecíficos, de mayor a menor, es: 1) avidina, estreptavidina 2) y NeutrAvidin 3) proteína.

El método indirecto, aparte de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que sólo un número relativamente pequeño de estándar conjugados anticuerpos secundarios (etiquetados) debe ser generado. Por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado contra conejo IgG, que se puede comprar "off the shelf", es útil con cualquier anticuerpo primario creció en conejo. Con el método directo, sería necesario etiquetar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés.

Counterstains

Después de inmunohistoquímica tinción del antígeno blanco, una segunda mancha se aplica a menudo para proporcionar contraste que ayuda a que el colorante primario destacan. Muchas de estas manchas muestran especificidad para clases específicas de biomoléculas, mientras que otros mancharán la célula entera. Colorantes cromogénicos y fluorescentes están disponibles para IHC proporcionar una amplia gama de reactivos para caber cada diseño experimental e incluyen: hematoxilina, Tinción de Hoechst y DAPI se utilizan comúnmente.

Solución de problemas de CCI

En técnicas de inmunohistoquímica, hay varios pasos antes de la coloración final del antígeno del tejido, y muchos problemas potenciales afectan el resultado del procedimiento. Las áreas de mayor problema en IHC tinción incluyen tinción de fondo fuerte, objetivo débil tinción de antígenos y autofluorescencia. Enzimas endógenas de biotina o reportero o anticuerpo primario y secundario reactividad cruzada son causas comunes de la tinción de fondo fuerte, mientras que la tinción débil puede ser causado por la actividad enzimática deficiente o potencia del anticuerpo primario. Además, autofluorescencia puede ser debido a la naturaleza de los tejidos o el método de fijación. Estos aspectos de IHC tejido de preparación y tinción de anticuerpos deben abordarse sistemáticamente para identificar y superar problemas de tinción.

Marcadores diagnósticos de IHC

La coloración de Immunohistochemical de la normal riñón con CD10.

IHC es una técnica de detección excelente y tiene la enorme ventaja de ser capaces de demostrar exactamente donde una proteína dada se encuentra en el tejido examinado. También es una manera eficaz para examinar los tejidos. Esto ha hecho una técnica ampliamente utilizada en la Neurociencias, permitiendo a los investigadores examinar la expresión de la proteína dentro de las estructuras específicas del cerebro. Su desventaja principal es, a diferencia de immunoblotting técnicas donde la coloración se comprueba con una peso molecular escala, es imposible Mostrar en IHC que la mancha se corresponde con la proteína de interés. Por esta razón, los anticuerpos primarios deben ser validados en una Western Blot o procedimiento similar. La técnica es más ampliamente utilizada en el diagnóstico patología quirúrgica immunophenotyping de tumores (e.g. immunostaining para la e-cadherina diferenciar entre CDIS (carcinoma ductal in situ: se tiñe positivo) y CLIs (carcinoma lobular in situ: no mancha positiva)). Más recientemente, técnicas inmunohistoquímicas han sido útiles en el diagnóstico diferencial de múltiples formas de carcinomas de cuello, cabeza y glándulas salivales.

La diversidad de los marcadores de IHQ utilizado en diagnóstico patología quirúrgica es substancial. Muchos laboratorios clínicos en hospitales terciarios tendrán menús de más de 200 anticuerpos utilizados como biomarcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos. Ejemplos de algunos marcadores comúnmente usados incluyen:

• Cytokeratins:: utilizado para la identificación de los carcinomas, pero también se puede expresar en algunos de los sarcomas.
• CD15 y CD30: utilizado para Enfermedad de Hodgkin
• Alfa-fetoproteína:: para tumores del saco vitelino y carcinoma hepatocelular
• CD117 (KIT): para tumores stromal gastrointestinales (GIST) y tumores de la célula de mástil
• CD10 (CALLA): para carcinoma de células renales y leucemia linfoblástica aguda
• Antígeno prostático específico (PSA): para cáncer de próstata
• estrógenos y progesterona receptor (ER y PR) tinción son utilizadas tanto diagnóstico (tumores de mama y Ginecología), así como pronósticos en cáncer de mama y predictores de respuesta a la terapia (receptor de estrógeno)
• Identificación de los B-cell linfomas utilizando CD20
• Identificación de los Célula de T linfomas utilizando CD3

Dirigir terapia

Una variedad de vías moleculares son alterados en el cáncer y algunas de las alteraciones pueden ser objeto de terapia del cáncer. Inmunohistoquímica puede utilizarse para evaluar que los tumores son capaces de responder a la terapia, al detectar la presencia o los niveles elevados de la diana molecular.

Inhibidores químicos

Biología del tumor permite una serie de potenciales dianas intracelulares. Muchos tumores son dependiente de la hormona. La presencia de receptores hormonales puede utilizarse para determinar si un tumor es potencialmente sensible a la terapia antihormonal. Una de las primeras terapias fue el antiestrógeno, tamoxifeno, se usa para tratar el cáncer de mama. Tales receptores de la hormona pueden detectarse por inmunohistoquímica. Imatinib, un intracellualar tirosina quinasa inhibidor, fue desarrollado para tratar leucemia mielógena crónica, una enfermedad caracterizada por la formación de una quinasa de tirosina anormal específico. Imitanib ha demostrado ser eficaz en los tumores que expresan otras tirosina quinasas, especialmente KIT. La mayor parte tumores stromal gastrointestinales KIT Express, que puede ser detectada por inmunohistoquímica.

Anticuerpos monoclonales

Artículo principal: Terapia del anticuerpo monoclonal

Caracterización del estado HER-2 de xenoinjertos de inmunohistoquímica de HER-2.

Muchas proteínas que se muestra ser muy upregulated en estados patológicos por inmunohistoquímica son potenciales dianas para las terapias utilizando anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales, debido a su tamaño, se utilizan contra blancos de superficie celular. Entre los objetivos overexpressed son miembros de la receptor del factor de crecimiento epidérmico Familia (EGFR), proteínas transmembrana con un dominio extracelular del receptor una cinasa de tirosina intracelulares de regulación. De éstos, HER2/neu (también conocido como Erb-B2) fue el primero en ser desarrollado. La molécula se expresa altamente en una variedad de tipos de la célula de cáncer, especialmente cáncer de mama. Así, los anticuerpos contra HER2/neu han sido FDA aprobada para el tratamiento clínico del cáncer bajo el nombre de la droga Herceptin. Hay estudios de inmunohistoquímica comercialmente disponible, Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle y Ventana Vía.

Del mismo modo, EGFR (HER-1) se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo cabeza y cuello y colon. Inmunohistoquímica se utiliza para determinar a los pacientes que pueden beneficiarse de anticuerpos terapéuticos tales como Erbitux (cetuximab). Sistemas comerciales para detectar EGFR por immunohistochemistry incluyen el pharmDx Dako.

Véase también

• Condiciones cutáneas con resultados de la inmunofluorescencia
• Hibridación in situ cromogénico

Enlaces externos

• Ramos Vara JA, Molinero MA (2014). "Cuando llevan tejido antígenos y anticuerpos: revisar los aspectos técnicos de la inmunohistoquímica, la técnica de roja, marrón y azul.". Patología Veterinaria 51 (1): 42 – 87. doi:10.1177/0300985813505879. PMID24129895.
• Resumen de inmunohistoquímica--describe todos los aspectos de IHC incluyendo preparación de la muestra, coloración y solución de problemas
• Métodos de tinción histoquímica - Universidad de Rochester Departamento de patología
• Protocolo de tinción de inmunohistoquímica
• Burnett Y Guichard, R Barale E (1997). «Immunohistochemistry para microscopía óptica en la evaluación de seguridad de agentes terapéuticos: una descripción ". Toxicología 119 (1): 83 – 93. doi:10.1016/S0300-483 X (96) 03600-1. PMID9129199.
• Immunohistochemistry en las Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina Encabezamientos de temas médicos (MeSH)
• Joyner, A.; Pared, N. (2008). «Immunohistochemistry de embriones de ratón de Whole-Mount». Protocolos de Cold Spring Harbor 2008 (2): pdb.prot4820. doi:10.1101/PDB.prot4820.

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