Péptido masa fingerprinting

Péptido masa fingerprinting (PMF) (también conocido como identificación de proteínas) es una técnica analítica para proteína identificación en la que la proteína desconocida de interés es dividida primero en pequeños péptidos, cuyas masas absolutas pueden medirse con precisión con un Espectrómetro de masas tales como MALDI-TOF o ESI-TOF. El método fue desarrollado en 1993 por varios grupos de forma independiente. Las masas peptídicas se comparan ya sea una base de datos que contienen secuencias de la proteína conocida o incluso el genoma. Esto se logra mediante el uso de programas informáticos que traducen el genoma conocido del organismo a las proteínas, entonces teóricamente cortan las proteínas en péptidos y calcular las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. A continuación se comparan las masas de los péptidos de la proteína desconocida para las masas peptídicas teóricas de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados se analizaron estadísticamente para encontrar a la mejor coincidencia.
La ventaja de este método es que sólo las masas de los péptidos tienen que conocerse. Desperdiciadores de tiempo secuenciación de péptidos de novo entonces es innecesario. Una desventaja es que la secuencia de la proteína tiene que estar presente en la base de datos de interés. Algoritmos PMF además la mayoría asumen que los péptidos provienen de una sola proteína. La presencia de una mezcla puede complicar significativamente el análisis y potencialmente comprometer los resultados. Típico para el PMF identificación basada en proteínas es el requisito para una proteína aislada. Mezclas superiores a un número de proteínas 2-3 por lo general requieren el uso adicional de MS/MS basado en la identificación de proteínas para lograr suficiente especificidad de identificación (6). Por lo tanto, las muestras típicas de PMF son proteínas aisladas de electroforesis en gel bidimensional (Geles 2D) o aisladas SDS-PAGE bandas. Análisis adicionales por MS/MS puede ser tanto directo, por ejemplo, análisis de MALDI-TOF/TOF o downstream nanoLC-ESI-MS/MS análisis de eluatos spot gel.

Preparación de la muestra

Las muestras de proteína se pueden derivar de SDS-PAGE y luego con algunas modificaciones químicas. Se reducen los puentes disulfuro en las proteínas y los aminoácidos cisteína son carbamidomethylated químicamente o acrylamidated durante la electroforesis en gel.

Luego se cortan las proteínas en varios fragmentos usando enzimas proteolíticas tales como tripsina, quimotripsina o Glu-C. Un ejemplo típico: proteasa relación de es: 1. La proteolisis típicamente se lleva a cabo durante la noche y los péptidos resultantes se extraen con acetonitrilo y se seca bajo vacío. Los péptidos son luego disuelven en una pequeña cantidad de agua destilada o más concentraron y purificaron usando puntas de pipeta ZipTip y están listos para el análisis de espectrometría de masa.

Análisis de espectrometría de masa

La proteína digerida puede ser analizada con diferentes tipos de espectrómetros de masas como ESI-TOF o MALDI-TOF. MALDI-TOF es a menudo el instrumento preferido ya que permite que un rendimiento alto y varias proteínas pueden analizarse en un solo experimento, si se complementa con MS/MS Análisis.

Una pequeña fracción del péptido (generalmente 1 microlitro o menos) es pipetea en un MALDI blanco y un producto químico llaman un matriz de se agrega a la mezcla de péptidos. Las moléculas de la matriz son necesarias para la desorción de las moléculas peptídicas. Las moléculas de la matriz y el péptido Co cristalizan en el destino MALDI y están listas para ser analizados.

El blanco se inserta en la cámara de vacío del espectrómetro de masas y la desorción y la ionización de los fragmentos de polipéptidos es iniciada por un haz láser pulsado que transfiere grandes cantidades de energía en las moléculas de la matriz. La transferencia de energía es suficiente para promover la ionización y la transición de péptidos y moléculas de la matriz de la fase sólida a la fase de gas. Los iones son acelerados en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y volar hacia un detector de iones donde su llegada es detectada como una señal eléctrica. Su relación masa / carga es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) en la deriva del tubo y se puede calcular en consecuencia.

Análisis computacional

El análisis de espectrometría de masa produce una lista de los pesos moleculares de los fragmentos que a menudo se llama una lista de pico. Las masas peptídicas se comparan con bases de datos de proteínas tales como SwissProt, que contienen información de secuencia de proteínas. Software realiza en silico digiere proteínas en la base de datos con la misma enzima (por ejemplo, tripsina) utilizado en la reacción química del escote. La masa de estos fragmentos de péptido entonces es calculada y comparada con la lista de pico de masas de péptidos medido. Los resultados se analizaron estadísticamente y posibles coincidencias se muestran en una tabla de resultados.

Véase también

• Spectrometry total de proteínas
• Proteomics de la escopeta
• Proteómica de arriba hacia abajo
• Proteómica de abajo hacia arriba

Enlaces externos

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