QPNC-PAGE
QPNC-PAGE, o electroforesis cuantitativa preparativa nativos continua gel de poliacrilamida, se aplica una técnica de alta resolución en Bioquímica y química de Bioinorganic para separar proteínas por punto isoeléctrico. Esto estandarizado variante de nativos electroforesis en gel de es utilizado por biólogos para aislar activos o nativo metaloproteinas en biológica muestras y para resolver correctamente e incorrectamente doblado metal cofactor-que contengan proteínas o isoformas de proteínas proteína compleja mezclas.[1]
Contenido
- 1 Tampón de electroforesis y dispositivo
- 2 Propiedades de gel y gel
- 3 Reproducibilidad y recuperación
- 4 Identificación y cuantificación
- 5 Aplicaciones
- 6 Historia y nuevo principio
- 7 Véase también
- 8 Referencias
- 9 Enlaces externos
Tampón de electroforesis y dispositivo
El procedimiento QPNC-PAGE se logra en un comercialmente disponibles electroforesis cámara para separación de cargado biomoléculas. Debido a las propiedades específicas de los gel preparados y electroforesis solución tampón (que es básico y contiene Tris-ICM y NaN3), la mayoría de las proteínas de un sistema biológico están cargadas negativamente en la solución y se migran desde el cátodo a la ánodo de debido a la campo eléctrico.[2]
Aunque el pH valor (10.00) del buffer de electroforesis no corresponde a un fisiológico valor de pH dentro de un célula o tejido tipo, son las bandas de proteínas en forma de anillo separado eluida continuamente en una solución tampón fisiológico (pH 8.00) y aislados en diferentes fracciones (véase la figura Electroferograma). Mayoría de las moléculas de proteínas es estable en solución acuosa, con valores de pH de 3 a 10 si la temperatura está por debajo de 50 ° C. El sistema de separación, incluyendo la cámara de electroforesis y fracción colector, se enfría en el refrigerador a 4 ° C (ver figura Equipo).[3]
Propiedades de gel y gel
El tiempo de polimerización del gel puede afectar directamente los tiempos pico de elución de metaloproteinas separados en el electroferograma debido a la compresión de los geles y los poros con los tiempos de incubación más largo (ver figura Electroferograma). Para asegurar la máxima reproducibilidad en tamaño del poro del gel y para obtener un gel de poro grande completamente polimerizado y no restrictivo para una página que se ejecuta, el gel de poliacrilamida se polimeriza por un período de 69 h a temperatura ambiente. El exotérmica calor generado por los procesos de polimerización es se disipó constantemente. El más bajo energía Estado del gel se produce después de 69 horas de polimerización. Como resultado, el gel preparado es homogénea, inherentemente estable y libre de monómeros de o radicales. Geles de poliacrilamida frescos son más hidrófilo, eléctricamente neutro y no vinculan a las proteínas.[4]
El 4% T, 2.67% C gel es pre-ejecutarlo a equilibriate. Es esencialmente no tamizado y óptimo para electroforesis de proteínas que son más pequeños y más grandes que 200 ku. Las proteínas migran en él más o menos sobre la base de su libre movilidad.[5] Por estas razones interacciones del gel con las biomoléculas son insignificante baja y las proteínas por separado limpio y predecible. Las metaloproteinas separados (por ejemplo, metal acompañantes, los priones, proteínas de transporte metálica amiloides, metalloenzimas, metallopéptidos (< 6 ku)) no son disociados en apoproteínas y cofactores del metal.[6]
Reproducibilidad y recuperación
Los bioactivos estructuras (nativo o 3D conformación) de la proteína aislada moléculas no sufren ningún significativo cambios conformacionales. Metales que contiene el cofactor las proteínas activas pueden ser aisladas manera reproducible en las mismas fracciones después una página ejecutar (ver figura Electroferograma). Un pico de desplazamiento en el electroferograma correspondiente o bien puede indicar que un desnaturalizado metalloprotein está disponible en la original mezcla de proteínas a separar o el tiempo estandarizado de gel de polimerización (69 hr, RT) no está implementada en una página experimento. Una desviación menor de esta estandarizado significa tiempo polimerización polimerización incompleta, mientras que exceder este límite de tiempo es un indicador de gel envejecimiento (véase la figura Electroferograma). Bajo condiciones estándar de metaloproteinas con diferentes rangos de masas moleculares y puntos isoeléctricos han sido recuperados en forma biológicamente activa en una producción cuantitativa de más del 95%.[7]
Identificación y cuantificación
Concentraciones bajas)MPP-gama) de Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr, Cd y otros cofactores metálicos pueden ser identificados y absolutamente cuantificadas por plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas (ICP-MS), por ejemplo. En el proceso de la información estructural de las moléculas asociadas se pierde irreversiblemente. Debido a la alta pureza y optimizado concentración de las metaloproteinas separados, por ejemplo, terapéuticos recombinantes hecho de planta farmacéutica como chaperona de cobre para la superóxido dismutasa (CCS) de plantas medicinales, en unas fracciones de página específicas, las estructuras relacionadas de estos analitos puede ser aclarada cuantitativamente mediante el uso de solución Espectroscopia de RMN en condiciones no desnaturalizantes.[8]
Aplicaciones
Proteínas metales mal dobladas, por ejemplo, CCS o superóxido dismutasa (SOD1) presentes en cerebro, sangre o de otras muestras clínicas, son indicativos de enfermedades neurodegenerativas como Enfermedad de Alzheimer (AD) o Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS). Activo CCS o SOD las moléculas contribuyan a intracelular homeostática de los mismos control de esencial iones del metal (p. ej., Cu1 + / 2 +, Zn2+, Fe2 + / 3 +) en organismos y así, pueden equilibrar estas biomoléculas pro-oxidativo y antioxidante procesos de En citoplasma.[9] En la actualidad, página continua nativa preparatoria cuantitativa es aplicada en el campo de la biología molecular para purificar enzimas y proteínas recombinantes de microbiana cepas.[10]
Historia y nuevo principio
En el siglo XX estaba generalmente aceptado que persulfato de amonio/TEMED-reacciones iniciadas se debe continuar por 2 horas asegurar la máxima reproducibilidad en gel tamaño del poro de los geles de la página.[11] Así, tiempos de incubación más largos no tenga ningún efecto esencial en el proceso de separación de proteínas aunque el monómero residual permanece más allá de este período de tiempo. Estos puntos de vista, sin embargo, han cambiado fundamentalmente.
En 2001 fue descubierto un nuevo principio básico de la electroforesis en gel en la Forschungszentrum Jülich. Esto indica que el tiempo de polimerización de un gel de poliacrilamida directamente afecta el resultado de un purificación de proteínas porque las propiedades de separación que implica la mecánica y estabilidad química de un gel y sus poros están determinados por este parámetro. Como consecuencia, la elución pico veces que implica la recuperación de las proteínas separadas en el electroferograma y reproducibilidad puede variar considerablemente. En consecuencia, estos procedimientos resultan en una pérdida de calidad de mediciones analíticas. Por otra parte los resultados de electroforesis de proteínas puede ser optimizada en términos de fiabilidad por adherencia terminante a un tiempo estandarizado de polimerización para geles de la página.[12]
Principio como una parte integral de una nueva técnica se aplicó para patente en 2003 y posteriormente emitido en el año 2014.[13] Varias publicaciones con respecto a las aplicaciones de esta técnica fueron editados o coauthored por el bien conocido American científico y experto reconocido internacionalmente en el campo de la electroforesis de proteínas David E. Garfin. En la década de 1970 y principios de los ochenta el Dr. Garfin se convirtió en uno de los principales investigadores y pioneros en el campo de la prión investigación en el equipo de Stanley B. Prusiner.[14] Para importantes contribuciones a electroforesis Dave Garfin recibió el premio 2013 AES electroforesis sociedad carrera en San Francisco.[15]
Véase también
- Electroforesis en gel de
- Electroforesis de proteínas
- Purificación de proteínas
Referencias
- ^ H Seelert, Krause F (2008). "Aislamiento preparativo de complejos de proteína y otros biopartículas por elución de geles de poliacrilamida". Electroforesis 29 (12): 2617-36. doi:10.1002/ELPS.200800061. PMID18494038.
- ^ Youn HD, Kim EJ, huevas de JH, Hah YC, Kang así (1996). «Una novela que contiene níquel superóxido dismutasa de Streptomyces spp». Diario bioquímico 318 (Pt 3): 889 – 96. PMC1217701. PMID8836134.
- ^ McLellan T (1982). "Tampones de electroforesis para geles de poliacrilamida a pH diferentes". Bioquímica analítica 126 (1): 94 – 99. doi:10.1016/0003-2697 (82) 90113-0. ISSN0003-2697. PMID7181120.
- ^ Garfin DE (2009). «25 reunión anual de la sociedad americana de electroforesis». De expertos de la proteómica 6 (3): 239-241. doi:10.1586/EPR.09.18. PMID19489696.
- ^ Garfin DE (2009) [1990]. «Capítulo 29 unidimensional electroforesis». Métodos en enzimología 463:: 497-513. doi:10.1016/S0076-6879 (09) 9 63029. ISBN978-0-12-374536-1. PMID19892189.
- ^ N Fitri, B Kastenholz, B Buchari, Amran MB, Warganegara FM (2008). "Especiación de molibdeno en la savia del líber crudo de ricino". Letras analítica 41 (10): 1773 – 84. doi:10.1080/00032710802162442. ISSN0003-2719.
- ^ B Kastenholz (2006). "Contribuciones importantes de un nuevo procedimiento de electroforesis (QPNC-PAGE) cuantitativa preparativa nativos continua gel de poliacrilamida para elucidar metal cofactor metabolismos en enfermedades mal plegamiento de la proteína – una teoría". Letras de péptido y proteína 13 (5): 503-8. doi:10.2174/092986606776819637. PMID16800806.
- ^ B Kastenholz, Garfin DE (2009). «Plantas medicinales: una natural chaperones fuente para el tratamiento de trastornos neurológicos». Letras de péptido y proteína 16 (2): 116-120. doi:10.2174/092986609787316234. PMID19200033.
- ^ Robinson NJ, DR Winge (2010). "Cobre metallochaperones". Revisión anual de la bioquímica 79:: 537 – 562. doi:10.1146/annurev-bioquímica-030409-143539. PMID20205585.
- ^ https://www.biomig.Boun.edu.TR/biomig/Research.html
- ^ Wittig I, Braun H-P, Schägger H (2006). «Página nativa azul». Protocolos de la naturaleza 1 (1): 418-428. doi:10.1038/nprot.2006.62. PMID17406264.
- ^ Aislamiento de metaloproteinas ácidos, básicos y neutros por QPNC-PAGE
- ^ Alemán DE patente 10336540
- ^ Prusiner SB, DE Garfin, Cochran SP, McKinley MP, Groth DF, Hadlow WJ, raza RE, CM Eklund (1980). «Tembladera experimental en el ratón: electroforético y propiedades de sedimentación del agente parcialmente purificado». Diario de la neuroquímica 35 (3): 574-582. doi:10.1111/j.1471-4159.1980.tb03693.x. PMID6778963.
- ^ AES 2013: Reunión anual de la sociedad de electroforesis AES
Enlaces externos
- Garfin DE. "Electroforesis de proteínas". Focos de aplicación de AES
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