Reacción en cadena de polimerasa digital

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Reacción en cadena de polimerasa digital (PCR digital, DigitalPCR, dPCR o dePCR) es un refinamiento del convencional reacción en cadena de polimerasa métodos que pueden utilizarse para cuantificar directamente y clonally amplificar ácidos nucleicos DNA, cDNA o RNA. La diferencia clave entre dPCR y mentiras PCR tradicionales en el método de medición de cantidades de los ácidos nucleicos, con el anterior es un método más preciso que la PCR, aunque también más propenso a errores en las manos de usuarios inexpertos.[1]:: 217 PCR se lleva a cabo una reacción por muestra. dPCR también lleva a cabo una sola reacción dentro de una muestra, sin embargo la muestra se separa en un gran número de particiones y la reacción se lleva a cabo en cada partición individualmente. Esta separación permite una recolección más confiable y sensible medida de cantidades de ácido nucleico. El método se ha demostrado útil para el estudio de las variaciones en las secuencias del gene, como variantes de número de copia y las mutaciones de punto — y habitualmente se utiliza para clonal amplificación de las muestras para la"secuenciación de próxima generación."

Contenido

  • 1 Conceptos básicos de la PCR
  • 2 principio de funcionamiento de dPCR
  • 3 Desarrollo
    • 3.1 MIQE
  • 4 Referencias
  • 5 Enlaces externos
  • 6 Comentarios

Conceptos básicos de la PCR

Artículo principal: Reacción en cadena de polimerasa

El método de reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para cuantificar ácidos nucleicos por amplificación de una molécula de ácido nucleico con la enzima Polimerasa de la DNA. PCR convencional se basa en la teoría de que la amplificación es exponencial. Por lo tanto, los ácidos nucleicos puede ser cuantificados comparando el número de ciclos de amplificación y la cantidad de producto final de PCR a los de una muestra de referencia. Sin embargo, muchos factores complican este cálculo, creando incertidumbres e inexactitudes. Estos factores incluyen los siguientes: ciclos de amplificación inicial no pueden ser exponenciales; Amplificación por PCR mesetas eventualmente después de un incierto número de ciclos; y no puede amplificar una concentración inicial baja de moléculas de ácido nucleico Diana a niveles detectables. Sin embargo, la limitación más significativa de la PCR es que la eficiencia de amplificación de PCR en una muestra de interés puede ser diferente de la de muestras de referencia. Ya que la PCR es un proceso exponencial, sólo dos pueden observarse diferencias en la amplificación, afectar considerablemente la validez y precisión de los resultados.

principio de funcionamiento de dPCR

Una muestra se reparte para que las moléculas individuales de ácido nucleico dentro de la muestra son localizadas y concentradas dentro de muchas regiones distintas. (La captura o el aislamiento de las moléculas individuales de ácido nucleico se ha hecho en micro placas de pozos, tubos capilares, la fase dispersa de un emulsióny arreglos de cámaras miniatura, así como en superficies de unión de ácidos nucleicos.) El repartir de la muestra permite estimar el número de moléculas diferentes por asumiendo que la población de la molécula sigue la Distribución de Poisson. Como resultado, cada parte contendrá "0" o "1" de las moléculas o una reacción positiva o negativa, respectivamente. Después de la amplificación de la polimerización en cadena, los ácidos nucleicos pueden cuantificarse contando las regiones que contienen el producto final PCR, reacciones positivas. En PCR convencional, la cantidad de ciclos de amplificación de PCR es proporcional al número de copia inicial. dPCR, sin embargo, no es dependiente en el número de ciclos de amplificación para determinar la cantidad de muestra inicial, eliminando la dependencia exponencial de los datos incierto para cuantificar ácidos nucleicos Diana y por lo tanto proporciona la cuantificación absoluta.

Desarrollo

El papel original de dPCR fue publicado por el Dr. Alec Morley y Pamela Sykes en 1992. El objetivo fue cuantificar objetivos PCR, en lugar de la PCR amplificados en un intento de rastrear y medir el menor número absoluto de células leucémicas en un paciente con leucemia. El propósito era controlar enfermedad residual en pacientes con leucemia y así tratar a los pacientes en el momento posible más temprano de la detección de recurrencia de la enfermedad. Otras evoluciones de la tecnología permitida para uso más práctico de este método con un público más amplio, con pequeñas particiones creadas por las gotitas de la emulsión o la microfluídica.[2]

Un desarrollo ocurrió en 1995 con invenciones co por Brown en Cytonix y plata en el Institutos nacionales de salud de métodos de secuenciación empleando matrices de contención física de escala nanométrica (marrón, plata) y solo paso quantitization[3] y cámaras abiertas (marrón) con localizan colonias clonales en tubos capilares de 1D y 2D, macro, geles, cámaras libres y volúmenes afinidad superficies/partículas.[jerga] lo que resulta en una patente u. S. de 1997,[4] y patentes divisionales y continuación posteriores. Los conceptos de Electrowetting y microfluídica digital más fueron introducida (marrón) como uno de los medios de manipulación de volúmenes de fluido de nano.

Digital PCR ha demostrado ser una prometedora herramienta de vigilancia para enfermedades como el cáncer y como un extremo delantero vital para determinar el contenido genómico, incluyendo la secuenciación del genoma humano.[citación necesitada]

Basado en el concepto Vogelstein y Kinzler desarrollaron una tecnología llamada BEAMing (granos, emulsión, amplificación, magnetismo) y cuantificó las mutaciones de KRAS en el ADN de heces de pacientes con cáncer colorrectal.[5][6]

Importantes desarrollos adicionales han incluido mediante emulsión abalorios para PCR digital de Dressman y colegas.[7]

También ha resultado útil para el análisis de metilación heterogéneo.[8]

En el año 2006 Fluidigm introdujo el primer sistema comercial de PCR digital basado en el integrado fluídica circuitos (chips) que integran cámaras y válvulas para repartir muestras.

En 2008, Inostics empezaron a BEAMing servicios digitales de PCR para la detección de mutaciones en suero, plasma y tejidos.

QuantaLife desarrollado un método fundamentalmente distinto de la tecnología de partición, la gotita PCR Digital (ddPCR), que las particiones una muestra en gotitas de 20.000 y proporciona digital recuento de blancos de ácido nucleico. En 2011, Quantalife fue adquirida por el Bio-Rad Laboratories.[9]

En 2013, RainDance Technologies puso en marcha una plataforma digital de PCR basada en su tecnología de gota de picolitros-escala, que genera gotas tamaño picolitros hasta 10 millones por carril.[10][11] La tecnología primero fue demostrada en un artículo publicado en el laboratorio en un Chip por los científicos de la Université de Strasbourg y Université París Descartes.[11][12] Más adelante ese año, RainDance Technologies anunció una alianza con tecnologías integradas de la DNA para el desarrollo de reactivos para la plataforma digital de PCR.[13]

PCR digital tiene muchos aplicaciones, incluyendo la detección y cuantificación de bajo nivel patógeno, secuencias genéticas raras, copiar variaciones de número y expresión génica relativa de las células. Este método proporciona la información con precisión y exactitud.[neutralidad es se disputa] Clonal habilitado por PCR digital solo paso de amplificación es un factor clave para reducir el tiempo y el coste de muchos de los "secuenciación de próxima generación"métodos"y por lo tanto, lo que permite personal genomics.

MIQE

La "Mínima información para publicación de cuantitativa Digital PCR experimentos" o "digital MIQE" directrices son un conjunto amplio de mejores prácticas destinadas a aumentar la validez y comparabilidad de los experimentos PCR digitales divulgado en la literatura publicada.[1]:: 217 La guía se publicó en 2013 y se produjo tras la publicación en 2009 de "MIQE", una guía similar para cuantitativa PCR en tiempo real.[14][15] En los dos años siguientes a la publicación de "MIQE digital", menos del 20% de artículos publicados de PCR digitales han citado la pauta.[1]:: 217

Referencias

  1. ^ a b c Perkel, Jeffrey (mayo de 2015). "Guía nuestros experimentos de PCR". Noticias de tecnología. BioTechniques 58 (5): 217-21.open access publication - free to read
  2. ^ PJ de Sykes, Neoh SH, Morley AA et al (septiembre de 1992). "Cuantificación de objetivos para PCR por uso de limitar dilución.". BioTechniques 13 (3): 444 – 9. PMID1389177.Closed access
  3. ^ Kalinina, O; J marrón; Plata J (1997). «Nanoliter escala PCR con detección de TaqMan». Investigación de ácidos nucleicos 25 (10): 1999 – 2004. doi:10.1093/Nar/25.10.1999. PMC146692. PMID9115368.open access publication - free to read
  4. ^ Patente 6143496, Brown, JF; Plata, JE & Kalinina, OV, "Método de muestreo, amplificación y cuantificación de segmento de ácido nucleico, montaje de la reacción en cadena de polimerasa tener nanoliter-tamaño de la muestra cámaras y el método de Asamblea de relleno", publicado el 2000-11-07, asignado a Cytonix y nosotros Departamento de salud y servicios humanos
  5. ^ Vogelstein, B; Kinzler KW (1999). "PCR Digital". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 96 (16): 9236 – 41. doi:10.1073/pnas.96.16.9236. PMC17763. PMID10430926.open access publication - free to read
  6. ^ Pohl, G; Shih,-M (2004). Principio y aplicaciones de la PCR digital. De expertos de Diagnóstico Molecular (Informa) 4 (1): 41 – 7. doi:10.1586/14737159.4.1.41. PMID14711348.Closed access
  7. ^ Dressman, D; Yan H; Traverso G; Kinzler KW; Vogelstein B (2003). "Transformar las moléculas de ADN individuales partículas magnéticas fluorescentes para la detección y enumeración de las variaciones genéticas". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 100 (15): 8817-22. doi:10.1073/pnas.1133470100. PMC166396. PMID12857956.open access publication - free to read
  8. ^ MIKESKA, T; Candiloro IL; Dobrovic A (2010). "Las implicaciones de la metilación del ADN heterogénea para la cuantificación exacta de la metilación". Epigenomics 2 (4): 561 – 73. doi:10.2217/EPI.10.32. PMID22121974.open access publication - free to read
  9. ^ "Bio-Rad adquiere QuantaLife y tecnología PCR Digital" (Comunicado de prensa). Bio-reportes 05 de octubre de 2011.
  10. ^ "RainDance lanza plataforma PCR Digital; Demanda sensibilidad, funcionamiento costo superioridad". Insider de la polimerización en cadena. Genomeweb. 29 de marzo de 2012.(suscripción requerida)
  11. ^ a b Kubista, M. (01 de mayo de 2012). «Controladores y cañizos para qPCR». Artículo. Noticias de biotecnología e ingeniería genética 32 (9).
  12. ^ Pekin D, Y Skhiri, Baret JC y otros. (julio de 2011). "Detección cuantitativa y sensible de mutaciones raras mediante microfluídica basada en gotas". Laboratorio en un Chip 11 (13): 2156 – 66. doi:10.1039/c1lc20128j. PMID21594292.Closed access
  13. ^ "RainDance, socio IDT en consumibles para PCR Digital plataforma". GenomeWeb diario Noticias (Genomeweb). 15 de octubre de 2012.(es necesario registrarse)
  14. ^ Hernández JF; CA Foy; Benes V et al (junio de 2013). "Las directrices MIQE digitales: información mínima para los experimentos de publicación de cuantitativo PCR Digital". Química clínica 59 (6): 892 – 902. doi:10.1373/clinchem.2013.206375. open access publication - free to read
  15. ^ Bustin SA; Benes V; Garson JA et al (abril de 2009). "Las directrices MIQE: información mínima para la publicación de los experimentos PCR cuantitativa en tiempo real". Química clínica 55 (4): 611 – 22. doi:10.1373/clinchem.2008.112797. open access publication - free to read
  • Pinheiro LB, Coleman VA, Hindson CM et al (enero de 2012). "Evaluación de un formato de la reacción en cadena de polimerasa digital gota número cuantificación de ADN copia". Anal. Chem. 84 (2): 1003-11. doi:10.1021/ac202578x. PMC3260738. PMID22122760.

Enlaces externos

  • Protocolo PCR digital

Comentarios

  • Brenan C, Morrison T (otoño 2005). "Alto rendimiento, nanoliter PCR cuantitativa". Descubrimiento de la droga hoy: tecnologías 2 (3): 247-253. doi:10.1016/j.ddtec.2005.08.017.
  • Golpe, N. (2007). «Frontera siguiente de PCR». Métodos de naturaleza 4 (10): 869-875. doi:10.1038/nmeth1007-869.

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