Secuencia de transposones

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Secuencia de transposones (Tn-seq) combina mutagénesis de insertional Transposon con secuenciación masiva y en paralelo (MPS) de los sitios de inserción del transposón identificar genes que contribuyen a una función de interés en bacterias.

Transposons son altamente regulada, discreto DNA segmentos que pueden reubicar dentro del genoma. Son universales y se encuentran en Eubacterias, Archaea, y Eukarya, incluidos los seres humanos. Transposones, tiene gran influencia expresión génica y puede utilizarse para determinar la función del gene. De hecho, cuando un transposón se inserta en un gen, se interrumpirá la función del gen.[1] Debido a esa propiedad, transposons han sido manipuladas para su uso en mutagénesis del insertional.[2] El desarrollo de la secuenciación del genoma microbiano fue un gran avance para el uso de mutagénesis de transposon.[3][4][5] La función afectada por la inserción de un transposón podría vincularse con el gen interrumpido por secuenciar el genoma para localizar el sitio de inserción del transposón. Secuenciación masiva y en paralelo permite la secuencia simultánea de transposon sitios de inserción en mezclas grandes de diferentes mutantes. Por lo tanto, análisis de genoma completo es factible si transposons están colocados por todo el genoma en una colección de mutantes.[6]

Secuencia de transposones requiere la creación de una biblioteca de inserción de transposones, que contendrá un grupo de mutantes que colectivamente tienen inserciones de transposones en todos los genes no esenciales. La biblioteca se cultiva bajo la condición que sea de interés. Mutantes con transposones insertados en los genes requeridos para el crecimiento bajo la condición de prueba disminuirán en frecuencia de la población. Para identificar los genes se pierden, se amplifican secuencias que abarca los extremos del transposon por POLIMERIZACIÓN EN CADENA y secuenciadas por MPS para determinar la ubicación y la abundancia de cada mutación de inserción. La importancia de cada gen del crecimiento bajo la condición de prueba se determina mediante la comparación de la abundancia de cada mutante antes y después de crecimiento bajo la condición de ser examinada.[6] TN-seq es útil para ambos el estudio de la aptitud de un solo gen así como las interacciones de genes [7]

Signature-tagged mutagénesis (STM) es una técnica más que también implica la agrupación de mutantes de inserción de transposones para determinar la importancia de los genes interrumpidos bajo condiciones de crecimiento selectivo.[8] Versiones de alto rendimiento de STM utilizan microarrays genómicos, que son menos precisas y tienen un menor rango dinámico que la secuenciación masivamente paralela.[9] Con la invención de la secuencia de la generación siguiente, datos genómicos se convirtieron cada vez más disponibles. Sin embargo, a pesar del incremento en datos genómicos, nuestro conocimiento de la función del gen sigue siendo el factor limitante en nuestra comprensión del papel que juegan los genes.[10][11] Por lo tanto, una necesidad de un enfoque de alto rendimiento para el estudio de las relaciones genotipo-fenotipo como Tn-seq era necesaria.

Contenido

  • 1 Metodología
  • 2 Ventajas y desventajas
  • 3 Aplicaciones
  • 4 Referencias

Metodología

Inserción del transposón utilizando el método Tn-seq.

Secuencia de transposones comienza por transformar las poblaciones bacterianas con elementos transponibles utilizando bacteriófagos. TN-seq utiliza el transposon Himar I Mariner, un transposón común y estable. Después de la transformación, el ADN es hendido y amplificó la secuencia insertada a través de POLIMERIZACIÓN EN CADENA. Los sitios de reconocimiento para MmeI, una endonucleasa de restricción tipo IIS, pueden ser introducidos por un cambio de un solo nucleótido en las repeticiones del terminal de Mariner.[12] Está situado 4 bp antes del final de la repetición terminal. MmeI hace una 2 bp escalonada corta 20 bases aguas abajo del sitio de reconocimiento.[13] Cuando MmeI digiere el ADN de una biblioteca de mutantes de inserción de transposones, fragmentación ADN como la izquierda y derecha transposon 16 bp de DNA genómico de alrededor se produce. El fragmento de bp 16 es suficiente para determinar la ubicación de la inserción del transposón en el genoma bacteriano. La ligadura del adaptador es facilitada por la proyección de la base 2. Una cartilla específica para el adaptador y una cartilla específica para la transponson se utilizan para amplificar la secuencia por PCR. El producto bp 120 es aislado mediante gel de agarosa o purificación de la página. Secuenciación masiva y en paralelo se utiliza para determinar las secuencias de acompañamiento 16 bp.[7] Funciones de los genes se deduce después de ver los efectos de la inserción en la función del gen bajo ciertas condiciones.

Ventajas y desventajas

A diferencia de la pista de inserción de alto rendimiento de secuenciación profunda (HITS) y secuenciación del sitio de inserción dirigida de transposon (TraDIS), Tn-seq es específico de la HIMAR I transposon Mariner, y no se puede aplicar a otros transposones o elementos del insertional.[7] Sin embargo, el protocolo para Tn-seq es menos tiempo intensivo. GOLPES y TraDIS utilizar ADN esquila técnica que producen una gama de POLIMERIZACIÓN EN CADENA tamaños del producto que podrían causar más plantillas de la DNA ser amplificadas preferencial sobre plantillas más. TN-seq produce un producto uniforme en tamaño, por lo tanto reduciendo la posibilidad de sesgo de la polimerización en cadena.[7]

TN-seq puede usarse para identificar tanto la aptitud de genes individuales y a las interacciones de genes en microorganismos. Los métodos existentes para este tipo de estudio dependen de microarrays genómicos preexistentes o gene knockout matrices, mientras que Tn-seq no es. Utilización de TN-seq de secuenciación masiva y en paralelo hace esta técnica fácilmente reproducible, sensible y robusto.[7]

Aplicaciones

TN-seq ha demostrado para ser una técnica útil para la identificación de nuevas funciones del gene. La naturaleza altamente sensible de Tn-seq puede utilizarse para determinar las relaciones fenotipo-genotipo que pueden han sido consideradas como insignificantes por métodos menos sensibles. TN-seq identificado genes esenciales y las vías que son importantes para la utilización del colesterol en Tuberculosis de la micobacteria.

TN-seq se ha utilizado para el estudio de la mayor organización de genoma de orden utilizando las interacciones del gene. Función de los genes como una red altamente vinculada; para estudiar el impacto de un gen en el fenotipo, también deben considerarse las interacciones del gene. Estas redes de genes pueden ser estudiadas por la investigación para las interacciones letalidad y gene sintético donde un doble mutante muestra un valor de fitness inesperado frente a cada individuo mutante. TN-seq se utilizó para determinar las interacciones genéticas entre cinco genes de la consulta y el resto del genoma en Streptococcus pneumoniae, que reveló agravantes y aliviar las interacciones genéticas.[14] Uno de lo genes estudiados (ccpA) fue encontrado para interactuar con 64 otros genes y se cree que un metabolismo de carbohidrato complejo regulador principal en Streptococcus pneumoniae.[7]

TN-seq que se usa en combinación con RNA-seq puede ser utilizado para examinar el papel de las regiones de ADN no codificante. Este método identificado 56 contiene nuevas en regiones no codificantes de S. pneumoniae.[15]

Referencias

  1. ^ Hayes, Finbar (2003). "Estrategias basadas en el transposón microbiana genómica funcional y proteómica". Revisión anual de la genética 37 (1): 3-29. doi:10.1146/annurev.Genet.37.110801.142807.
  2. ^ Kleckner, Nancy; et al (1975). "Mutagénesis por inserción de un elemento de resistencia a los fármacos con una repetición invertida". Diario de la Biología Molecular 97 (4): 561-575. doi:10.1016/s0022-2836 (75) 80059-3. PMID1102715.
  3. ^ Smith, V; et al (1995). "Huella genética: una estrategia genómica para determinar la función de un gen dada su secuencia". Actas de la Academia Nacional de Ciencias 92 (14): 6479-6483. Bibcode:1995PNAS... 92.6479S. doi:10.1073/pnas.92.14.6479.
  4. ^ Smith, V; et al (1996). "Análisis funcional de los Genes del cromosoma de levaduras V por huella genética". Ciencia 274 (5295): 2069-2074. Bibcode:1996Sci... 274.2069S. doi:10.1126/Science.274.5295.2069. PMID8953036.
  5. ^ ARKLEY, B.J.; et al (1998). "Identificación sistemática de Genes esenciales por en Mariner Vitro mutagénesis". Actas de la Academia Nacional de Ciencias 95 (15): 8927. Bibcode:1998PNAS... 95.8927A. doi:10.1073/pnas.95.15.8927.
  6. ^ a b Van Opijnen, T; Camilli, A. (2013). "la secuencia de inserción de transposones: una nueva herramienta para el análisis de sistemas-nivel de microorganismos". Naturaleza comentarios microbiología 11 (7): 435-442. doi:10.1038/nrmicro3033. PMID23712350.
  7. ^ a b c d e f Van Opijnen, T; et al (2009). "Tn-seq: funcionamiento de secuenciación en paralelo estudios de interacción genética en microorganismos y fitness". Métodos de la naturaleza 6 (10): 767-772. doi:10.1038/nmeth.1377. PMC:: 2957483. PMID19767758.
  8. ^ Mazurkiewicz, P.C; et al (2006). "mutagénesis signature-tagged: mutantes de código de barras para las pantallas de todo el genoma". Naturaleza comentarios sobre genética 7 (12): 929-939. doi:10.1038/nrg1984. PMID17139324.
  9. ^ Barquist L, Boinett CJ, Caín AK (2013). "Se acerca a consultar genomas bacterianos con secuencias de inserción transposones". Biología del RNA 10 (7): 1161 – 9. doi:10.4161/RNA.24765. PMC: 3849164. PMID23635712.
  10. ^ Bork, P (2000). "poderes y trampas en el análisis de la secuencia: el 70% el cañizo". Investigación del genoma 10 (4): 398 – 400. doi:10.1101/gr.10.4.398. PMID10779480.
  11. ^ Kasif, S; Steffen, M. (2010). "Redes bioquímicas: la evolución de la anotación de genes". Nature Chemical Biology 6 (1): 4 – 5. doi:10.1038/nchembio.288. PMC: 2907659. PMID20016491.
  12. ^ Goodman, A.L.; et al (2009). "Identificación de determinantes genéticos necesarios para establecer un simbionte del intestino humano en su hábitat". Célula huésped microbio 6 (3): 279-289. doi:10.1016/j.Chom.2009.08.003. PMC: 2895552. PMID19748469.
  13. ^ Morgan, R.D.; et al (2009). "la familia MmeI: tipo de enzimas de restricción, modificación II que emplean solo-filamento de la modificación para la protección del host". Ácidos nucleic Res 37 (15): 5208-5221. doi:10.1093/Nar/gkp534. PMC: 2731913. PMID19578066.
  14. ^ Van Opijnen, T; Camilli, A. (2013). "la secuencia de inserción de transposones: una nueva herramienta para el análisis de sistemas-nivel de microorganismos". Naturaleza Informe microbiología 11 (7): 435-442. doi:10.1038/nrmicro3033.
  15. ^ Mann, B; et al (2012). "Control de virulencia por small RNAs en Streptococcus pneumoniae".. PLoS Pathogens. doi:10.1371/journal.PPAT.1002788.

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