Unidades de fluorescencia relativa

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Los términos"unidades de fluorescencia relativa«(RFU)[1] y"Pico RFU"se refieren a las mediciones en electroforesis métodos, tales como para DNA Análisis. Una "unidad de fluorescencia relativa" es una unidad de medición utilizado en el análisis que emplea fluorescencia detección.[2] La fluorescencia se detecta mediante un dispositivo acoplado de carga Matriz (CCD), cuando los fragmentos marcados, que están separados dentro de un tubo capilar mediante el uso de electroforesis, se energizan por láser de luz y viajar a través de la ventana de detección. Un programa de computadora mide los resultados, determinar la cantidad o el tamaño de los fragmentos, en cada punto de datos, desde el nivel de intensidad de fluorescencia.[2] Las muestras que contienen mayores cantidades de ADN amplificado tendrá valores más altos de RFU correspondientes.[3][4]

Un "pico RFU" es un punto máximo relativo a lo largo de una gráfica de los datos analizados. Los datos pueden normalizarse al ADN genes de normalización adicional o entrada. Las alturas de la RFU pueden variar de 0 a 2000 o más.

Análisis de PCR de ADN

Se utilizan las mediciones de la RFU, para Perfiles de ADN, en un reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (PCR). Dos métodos comunes para la detección de productos de PCR en tiempo real son: inespecífica (1) tintes fluorescentes que intercalar cualquier ADN de doble hebra, y (2) secuencia-específica Sondas de ADN que consiste en oligonucleótidos que están marcados con un fluorescente reportero que permite la detección sólo después hibridación de la sonda con su objetivo de ADN complementario. Con frecuencia, PCR en tiempo real se combina con transcripción reversa para cuantificar ARN mensajero y ARN no codificante en células o tejidos.

Umbrales de pico RFU

La altura máxima RFU depende de la cantidad de ADN analizada. Cuando la cantidad de ADN es muy baja, entonces puede ser difícil separar un verdadero pico RFU bajo nivel de señal ruido u otras técnicas artefactos.[5] Como resultado, muchos laboratorios forenses de ADN han establecido niveles mínimos de altura del pico RFU en "anotar" el análisis de alelos.[5]

No existen reglas firmes toda la industria para establecer valores de umbral mínimos de la RFU.[5] Cada laboratorio, en general, ha establecido sus propios niveles de umbral como un aspecto de su procedimiento de validación. Muchos laboratorios han establecido umbrales superiores e inferiores para la interpretación de los datos, como una ventana de lecturas máximas y mínimas.[5]

Algunos niveles de umbral pueden obtenerse experimentalmente basándose en conocidos del equipo relación señal a ruido, o puede definir un umbral para que coincida con los datos publicados o las especificaciones del fabricante.[5] La empresa que vende el equipo más ampliamente utilizado para STR escribiendo, Applied Biosystems, Inc. (ABI), ha recomendado un mínimo de altura de pico de 150 RFU, aconsejando cómo picos por debajo de ese nivel deben ser juzgados con precaución. Sin embargo, muchos laboratorios forenses que tienen sistemas de ABI han determinado umbrales más bajos, a menudo solamente 50 a 100 RFU, según lo determinado por sus estudios.[5]

Muchos factores diferentes pueden afectar la elección de un laboratorio de umbrales.[5] Por ejemplo, puede haber normas regulatorias en jurisdicciones específicas. Además, diversas clases de instrumentos varían en sensibilidad (tales como gel de losa siendo menos sensibles que los instrumentos electroforesis capilar Instrumentos (CE)). Instrumentos individuales, de un tipo particular de modelo, también se han sabido para difieren en rendimiento (por ejemplo, diferencias entre distintas unidades de ABI 310, todos del mismo modelo). Electroforesis capilar instrumentos generalmente ofrecen una mejor resolución en comparación con sistemas basados en gel, así como tener mayor sensibilidad. Además, algunos laboratorios han establecido estándares de umbral diferentes dependiendo de cual se utilizan instrumentos en el laboratorio para un análisis.[5]

Establecer un umbral máximo superior es crítico cuando se analizan datos de ADN en muestras de alta cantidad.[5] Muestras con grandes cantidades de ADN amplificado reportaran altos niveles RFU que podrían sature la sensibilidad de un instrumento para medir los resultados. En tales casos, una medida exacta de la altura relativa del pico y zonas podría ser inalcanzable. Sobresaturación puede ser un problema al analizar muestras mixtas.[5]

Referencias

  1. ^ Durante más de un siglo, el término «RFU» ha sido asociado con la Unión del balompié del rugbi, fundada en 1871, y el término "Nivel de RFU" es común a este respecto.
  2. ^ a b "Unidad de fluorescencia relativa (RFU)", DNA.gov: Glosario, abril de 2011, página web: ADN-gov-RFU.
  3. ^ "Umbrales", NFSTC.org, 2010, página web: [1].
  4. ^ Gertsch J, J. M Güttinger, O Sticher, Heilmann (2002). "Cuantificación relativa de los niveles de mRNA en células Jurkat T RT real tiempo-PCR (RT-rt-PCR): nuevas posibilidades para la proyección de antiinflamatorio y citotóxica compuestos". Pharm Res 19:: 1236-1243. doi:10.1023 / A:1019818814336. PMID12240952.
  5. ^ a b c d e f g h i j "Avanzando en la justicia a través de la tecnología del ADN", Centro Nacional de tecnología de ciencia forense (NFSTC), 2011, web: NFS2.

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