Secuencia Nanopore

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Secuencia Nanopore es un método en desarrollo desde 1995 [1][2] para determinar el orden en que se producen nucleótidos en una hebra de DNA.

A nanopore es simplemente un pequeño agujero con un diámetro interno del orden de 1 nanómetro. Ciertas proteínas celulares transmembrana porosos actúan como interconectivos e interconectivos también han sido hechas por aguafuerte un agujero algo más grande (varias decenas de nanómetros) en una pieza de silicio y luego llenando poco a poco en el uso de escultura de la viga de ion métodos que resulta en un agujero de diámetro mucho más pequeño: el nanopore. Grafeno[3] también se está estudiando como un substrato sintético para estado sólido interconectivos.

poro de alfa hemolisina (conformada por 7 subunidades idénticas en 7 colores) y 12-mer monocatenario DNA (en blanco) en la misma escala para ilustrar efectos de ADN en la conductancia cuando se mueve a través de un nanopore. Abajo se encuentra una vista ortogonal de las mismas moléculas.

La teoría detrás de la secuencia nanopore es que cuando un nanopore es sumergido en un fluido conductor y se aplica un potencial (voltaje) a través de él, un corriente eléctrica debido a la conducción de iones a través de la nanopore puede observarse. La cantidad de corriente es muy sensible al tamaño y forma de la nanopore. Si solos nucleótidos (bases), hebras de ADN u otras moléculas pasen a través o cerca del nanopore, esto puede crear un cambio característico en la magnitud de la corriente a través de la nanopore.

Contenido

  • 1 Fondo
  • 2 Tipos de interconectivos
    • 2.1 Hemolisina alfa
    • 2.2 MspA
  • 3 Fluorescencia
  • 4 El hacer un túnel electrones
  • 5 Retos
  • 6 Comercialización
  • 7 Referencias
  • 8 Comentarios
  • 9 Los enlaces externos y referencias

Fondo

ADN podría pasar a través de la nanopore por varias razones. Por ejemplo, electroforesis podría atraer el ADN hacia el nanopore, y eventualmente podría pasar a través de él. O enzimas a la nanopore podrían guía de ADN hacia la nanopore. La escala de la nanopore significa que el ADN puede ser forzado a través del agujero como una letanía, una base a la vez, algo como el enhebrado a través del ojo de una aguja. Como lo hace, cada nucleótido en la DNA molécula puede obstruir la nanopore en grado diferente, característico. La cantidad de corriente que puede atravesar el nanopore en cualquier momento por lo tanto varía dependiendo de si el nanopore es bloqueado por una A, una C, una G o una T o una sección de ADN que incluye más de una de estas bases (kmer). El cambio en la corriente a través de la nanopore como la molécula de ADN atraviesa el nanopore representa una lectura directa de la secuencia de ADN. Alternativamente, podría utilizarse un nanopore para identificar las bases individuales del ADN como pasan a través de la nanopore en el orden correcto - este enfoque fue publicado pero no comercialmente desarrollado por Oxford Nanopore Technologies y profesor Hagan Bayley.[4]

Utilizando la secuencia Nanopore, una sola molécula de ADN puede ser secuenciada directamente usando un nanopore, sin la necesidad de una intervención POLIMERIZACIÓN EN CADENA etapa de amplificacion o un paso de etiquetado químico o la necesidad de instrumentación óptica identificar la etiqueta química. La versatilidad del concepto nanopore es subrayada por el hecho de que se también se ha propuesto para la detección de vida en otros planetas, ya que no necesariamente se limita a la detección de la portadora de información genética ADN, pero en general puede ser aplicado a portadores de información genética de la cadena-como la secuencia sin saber la estructura exacta de sus bloques de construcción.[5] Técnicas de análisis de ADN basados en Nanopore están desarrollando industrialmente Oxford Nanopore Technologies (desarrollo de filamento secuenciación utilizando proteína interconectivos y secuenciación de estado sólido a través de la i+d interna y colaboraciones con instituciones académicas). A partir de junio de 2015, el dispositivo de MinION de Oxford Nanopore ahora ha sido utilizado por un número de participantes en el programa de acceso de súbdito. Publicaciones sobre el método de describen su uso en la identificación rápida de patógenos virales, monitoreo de ebola, monitoreo ambiental, supervisión de la seguridad del alimento, monitoreo de resistencia a los antibióticos, haplotyping y otras aplicaciones. Otras compañías han señalado que tienen programas de Nanopore, NabSys (usar una biblioteca de ADN sondas y usando interconectivos para detectar donde estas sondas han cruzado por hibridación a solo trenzado DNA) y NobleGen (usando interconectivos en combinación con las etiquetas fluorescentes). IBM ha tomado nota de proyectos de investigación sobre las simulaciones de computadora del desplazamiento de un filamento de la DNA a través de un estado sólido nanopore, pero no proyectos en la identificación de las bases de ADN en ese filamento.

Tipos de interconectivos

Hemolisina alfa

Hemolisina alfa (αHL), un nanopore de bacterias que causa la lisis de los glóbulos rojos, se ha estudiado por más de 15 años.[2] A este punto, los estudios han demostrado que los cuatro bases pueden ser identificados usando corriente iónica medido a través del poro de la αHL.[6][7] La estructura de αHL es ventajosa para identificar bases específicas a través de los poros. El poro de la αHL es ~ 10 nm de largo, con dos secciones distintas de nm 5. La parte superior consta de una estructura mayor, como vestíbulo y la parte inferior consta de tres sitios de posible reconocimiento (R1, R2, R3) y es capaz de discriminar entre cada base.[6][7]

Secuenciación mediante αHL ha sido desarrollado a través de estudio básico y mutaciones estructurales, hacia la secuencia de lecturas muy largas. Mutación de la proteína de αHL ha mejorado las capacidades de detección del poro.[4] El siguiente paso propuesto es enlazar una exonucleasa en el poro αHL. La enzima hiende periódicamente bases únicas, permitiendo a los poros identificar bases sucesivas. Una exonucleasa de acoplamiento para el poro biológico lenta la translocación del ADN a través de los poros y aumentar la precisión de adquisición de datos.

Un estudio reciente ha señalado la capacidad de αHL para detectar nucleótidos en dos sitios separados en la parte inferior de la mitad de los poros.[8] Los sitios de R1 y R2 permiten cada base a ser monitoreados dos veces mientras se mueve a través de los poros, creando 16 diferentes valores actuales iónicos mensurables en vez de 4. Este método mejora la lectura sola a través de la nanopore duplicando los sitios que la secuencia es leída por nanopore.

MspA

Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) es el segundo nanopore biológica actualmente investigada por secuenciación de ADN. El poro de la MspA ha sido identificado como una potencial mejora en αHL debido a una estructura más favorable.[9] El poro se describe como una copa con un borde de grosor y un diámetro de 1,2 nm en el fondo del poro.[10] Una MspA natural, mientras que es favorable para la secuenciación de ADN debido a la forma y diámetro, tiene un núcleo negativo que prohíbe solo trenzado DNA(ssDNA) desplazamiento. Nanopore natural fue modificada para mejorar el desplazamiento mediante la sustitución de tres ácidos aspártico cargados negativamente con asparagina neutral.[11]

La detección de corriente eléctrica de nucleótidos a través de la membrana se ha demostrado ser diez veces más específico que αHL para la identificación de bases.[9] Utilizando esta especificidad mejorada, un grupo de la Universidad de Washington tiene uso propuesto doble trenzado DNA (dsDNA) entre cada molécula trenzado solo para mantener la base en la sección de lectura del poro.[9][11] El dsDNA sería detener la base en la sección correcta del poro y permitir la identificación de los nucleótidos. Una reciente subvención ha sido concedida a una colaboración de UC Santa Cruz, la Universidad de Washington y Universidad del noreste para mejorar el reconocimiento de la base de la utilización de MspA polimerasa phi29 junto con el poro.[12]

Fluorescencia

Una técnica eficaz para determinar una secuencia de ADN ha sido desarrollada utilizando interconectivos de estado sólido y fluorescencia.[13] Este método de secuenciación de fluorescencia convierte cada base en una representación característica de múltiples nucleótidos que se unen a una sonda fluorescente formando cadena dsDNA. Con el sistema de color de dos propuesto, cada base se identifica por dos fluorescencias independientes y por lo tanto se convertirá en dos secuencias específicas. Puntas de prueba consisten en un fluoróforo y extintor al comienzo y al final de cada secuencia, respectivamente. Cada fluoróforo se extingue por el extinguidor de arcos al final de la secuencia anterior. Cuando el dsDNA es translocación a través de un estado sólido nanopore, el filamento de la sonda que se quitó y el fluoróforo aguas arriba que es fluorescente.[13][14]

Este método de secuenciación tiene una capacidad de 50-250 bases por segundo por el poro y se secuencia de un sistema de fluoróforo de cuatro colores (cada base podría convertir en una secuencia en lugar de dos), sobre de 500 bases por segundo.[13] Ventajas de este método se basan en la lectura clara de la secuencia, usando una cámara en lugar de métodos actuales ruidosos. Sin embargo, el método requiere la preparación de la muestra para convertir cada base en un código binario expandido antes de la secuencia. En lugar de una base identificada como transloca a través de los poros, ~ 12 bases son requeridos para encontrar la secuencia de una base.[13]

El hacer un túnel electrones

Medición del electrón el hacer un túnel a través de bases como ssDNA se transloca a través de la nanopore es un método de secuenciación de nanopore mejorado de estado sólido. Mayoría de las investigaciones se ha centrado en probar bases podrían determinarse utilizando el hacer un túnel del electrón. Estos estudios se realizaron usando un microscopio de sonda como el electrodo de detección y han demostrado que bases pueden ser identificados por las corrientes del túnel específicas.[15] Después de la prueba de investigación de principio, se debe crear un sistema funcional par el poro de estado sólido y dispositivos sensores.

Investigadores del grupo de Harvard Nanopore han diseñado los poros de estado sólido con nanotubos de carbono pared única en todo el diámetro del poro.[16] Se crean matrices de poros y deposición de vapor químico se utiliza para crear nanotubos que crecen a través de la matriz. Una vez que ha crecido un nanotubo a través de un poro, el diámetro del poro se ajusta al tamaño deseado. Creación exitosa de un nanotubo juntada con un poro es un paso importante hacia la identificación de bases como el ssDNA se transloca a través de los poros de estado sólido.

Otro método es el uso de nanoelectrodos en ambos lados de un poro.[17][18] Los electrodos son creados específicamente para permitir la formación de un estado sólido nanopore entre los dos electrodos. Esta tecnología se podría utilizar para detectar no sólo las bases pero para ayudar a controlar la base de velocidad de desplazamiento y orientación.

Retos

Un reto para el método de 'secuencia de la hebra' fue en refinar el método para mejorar su resolución para detectar bases únicas. En los primeros métodos de papeles, un nucleótido necesita ser repetido en una secuencia de cerca de 100 veces sucesivamente para producir un cambio característico mensurable. Esta baja resolución es porque el filamento de la DNA se mueve rápidamente a una velocidad de 1 a 5μs por base a través de la nanopore. Esto hace grabación difícil y propenso al ruido de fondo, fallar en la obtención de resolución del solo-nucleótido. El problema es ser abordado mediante la mejora de la tecnología de grabación o controlando la velocidad del filamento de la DNA por proteínas diversas estrategias de ingeniería y Oxford Nanopore emplea un enfoque de kmer analizando más de una base en cualquier momento por lo que tramos de ADN están sujetas a repetición interrogatorio como la cadena mueve a través de la nanopore una base en un momento.[19] Se han utilizado varias técnicas incluyendo algorítmica para mejorar el rendimiento del esbirro tecnología puesto que era primera a disposición de los usuarios. Más recientemente se han demostrado efectos de bases únicas debido a la estructura secundaria o mononucleotides lanzados.[20][21] Profesor Hagan Bayley, fundador de Oxford Nanopore, propuso en 2010 que crear dos sitios de reconocimiento dentro de un poro de hemolisina alfa puede conferir ventajas en base reconocimiento.[22]

Un reto para el enfoque de exonucleasa[23] donde una enzima procesual alimenta las bases individuales, en el orden correcto, en nanopore, es integrar los sistemas de detección de nanopore y la exonucleasa. En particular,[24] el problema es que cuando una exonucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos en el ADN, los nucleótidos liberados posteriormente no está necesariamente garantizado para mover directamente a, digamos, un cercano alfa hemolisina nanopore. Una idea[24] es sujetar la exonucleasa que nanopore, quizás a través de Biotinilación a la barril beta hemolsyin. El poro central de la proteína puede ser forrado con residuos cargados dispuestos de modo que las cargas positivas y negativas aparecen en lados opuestos del poro. Sin embargo, este mecanismo es esencialmente discriminatoria y no constituye un mecanismo para guiar a nucleótidos por algún sendero particular.

Comercialización

Laboratorios Agilent fue la primera licencia de conducir y desarrollar interconectivos [25] pero no tiene ninguna investigación divulgada en el área.

La empresa Oxford Nanopore Technologies en el 2008 licenciado tecnología de Harvard, UCSC y otras universidades [26] desarrollo de estado sólido nanopore tecnología con el objetivo de la secuencia de la DNA y proteína e identificación de biomarcadores, drogas de abuso y una variedad de otras moléculas. Revelaron su primer dispositivo de trabajo en febrero de 2012.[27] La empresa presentó su dispositivo de detección de tamaño de bolsillo MinION a una comunidad de acceso temprano en principios de 2014.[28]

Sequenom tecnología nanopore licenciado de Harvard en 2007[29] utilizando un enfoque que combina interconectivos y etiquetas fluorescentes. Esta tecnología fue licenciada posteriormente a Noblegen.[30]

NABsys fue hecho girar de Brown University y está investigando interconectivos como método de identificación de áreas de trenzado único ADN que han sido hibridada con específicas sondas de ADN.

Genia aplicado para un patente en un método de secuenciación que utiliza una serie de ARN nanopore "-badén" moléculas para inferir la secuencia de la molécula basada en el patrón de progresión retardada.

Referencias

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Comentarios

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Los enlaces externos y referencias

  • Nanopore en China
  • Blog de Nanopore
  • Nanopore en Changchun

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