Restricción de oligómero

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Restricción de oligómero (abreviado OR) es un procedimiento para detectar una ADN alterado la secuencia en un genoma. Un etiquetado oligonucleótidos punta de prueba es cruzado por hibridación a un objetivo de ADN y luego tratado con un enzima de restricción. Si la sonda coincide exactamente con el blanco, la enzima de restricción se hienden la sonda, cambiar su tamaño. Si, sin embargo, el ADN diana coincide exactamente la sonda, la enzima de restricción no tendrá ningún efecto sobre la longitud de la sonda. La técnica de OR, ahora raramente realizada, fue estrechamente asociada con el desarrollo de los populares reacción en cadena de polimerasa Método (PCR).

Mecanismo de restricción del oligómero.

Contenido

  • 1 Ejemplo
  • 2 Historia
  • 3 Problemas
  • 4 Relación a la PCR
  • 5 Referencias

Ejemplo

En parte 1a del esquema de la sonda de oligonucleótidos, marcada en su extremo izquierdo (asterisco), se muestra en la línea superior. Es totalmente complementario a su ADN diana (tomado aquí de la gen de la β-hemoglobina humana), como se muestra en la siguiente línea. Parte de la sonda incluye la Sitio de reconocimiento para la restricción de la enzima Dde I (subrayada).

En la parte 1b, la enzima de restricción ha hendido la sonda y su blanco (Dde deja tres bases desapareados en cada extremo). El etiqueta final de la sonda está ahora a sólo 8 bases en longitud y se separa fácilmente por Electroforesis en gel de de la sonda sin cortar, que era 40 bases de largo.

En la parte 2, el mismo sondeo se muestra hibridizado con un objetivo de ADN que incluye una sola mutación base (aquí la mutación responsable de la Anemia de células falciformeso SCA). El híbrido no coinciden ya no actúa como un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción, y la sonda se mantiene en su longitud original.

Historia

La técnica de restricción oligómero fue desarrollada como una variación de la Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Método de ensayo (RFLP), con la esperanza de evitar el laborioso Borrar meridional paso utilizado en análisis de RFLP. O fue concebido por Randall Saiki y Henry Erlich en la década de 1980, trabajando en CETUS Corporation en Emeryville, California. Fue patentado en 1984[1] y publicado en 1985,[2] después de haber aplicado para la mutación genómica responsable Anemia de células falciformes. O de pronto fue substituida por la técnica más general de Oligonucleotide del específico del allele Sondas (ASO).[3]

Problemas

El método de restricción oligómero fue acosado por una serie de problemas:

  • Se podría aplicar solamente el pequeño conjunto de polimorfismos de ADN que alteran un sitio de restricción y sólo a aquellos sitios que conocía información de secuencia. Muchos de los conocidos ensayos RFLP detectan polimorfismos que estaban lejos de sus ubicaciones de sonda.
  • Es difícil de oligonucleótidos de etiqueta a un nivel suficientemente alto como para utilizarlos como sondas de ADN genómico. Este problema también plagaron el desarrollo de sondas ASO.
  • Es difícil diseñar oligonucleótidos y utilizarlos de manera que se conviertan en hibridación de sondas para un sitio dentro de un genoma. Enlace a sitios no específicos puede ocultar a menudo el efecto de la sonda en la ubicación de destino.
  • No todas las enzimas de restricción tienen la especificidad deseada para su secuencia de reconocimiento. Algunos pueden reconocer y cortar el ADN, y algunas muestran un bajo nivel de la hendidura para los sitios no coincidentes. Incluso una pequeña cantidad de escote no específicos puede pantano la débil señal de la secuencia de destino.
  • Es difícil diseñar un método OR que incluye controles para ambos de los alelos está probados. En la parte 2 del ejemplo simplificado descrito arriba, la sonda no fue hendida cuando cruzó por hibridación a un mutante destino. Pero el mismo resultado (no-) se produciría por el exceso de sonda unhybridized, así como si cualquier problema ocurrió impidiendo la digestión completa por enzima de la restricción. En el método real registrados,[2] un segundo sitio de la restricción no-polimórficas fue utilizado para cortar toda la sonda hibridada, y un segundo oligonucletide fue utilizado para 'bloquear' la sonda unhybridized. Estos controles no hubiera sido para otros objetivos.

Relación a la PCR

A pesar de sus limitaciones, la técnica de OR se beneficiaron de su asociación estrecha con el desarrollo de la reacción en cadena de polimerasa. Kary Mullis, que también trabajó en Cetus, habían sintetizado las sondas de oligonucleótidos ensayadas por Saiki y Erlich. Consciente de los problemas que fueron encontrando, él imaginó un método alternativo para el análisis de la mutación de SCA que utilizaría componentes de la Sanger Secuencia de la DNA técnica. Darse cuenta de la dificultad de cruzamiento por hibridación una cartilla del oligonucleótido a una ubicación única en el genoma, consideró usar una segunda cartilla en el filamento opuesto. Luego generalizó ese proceso y se dio cuenta de que extensiones repetidas de los dos iniciadores conduciría a un incremento exponencial en el segmento de DNA entre los iniciadores - un reacción en cadena de replicación catalizada por Polimerasa de la DNA.[4][5]

Como Mullis encontró su propia dificultades en la demostración de POLIMERIZACIÓN EN CADENA,[6] se unió a un grupo de investigadores que estaban abordando los problemas con o. Juntos, desarrollaron la PCR combinada-ensayo de OR. Por lo tanto, o se convirtió en el primer método utilizado para analizar la polimerización en cadena-amplificados de la DNA genomic.

Mullis también encontró dificultades en publicar la idea básica de la PCR (revistas científicas publican raramente conceptos sin el acompañamiento de resultados). Cuando su manuscrito para la revista Naturaleza fue rechazado, la descripción básica de PCR añadió apresuradamente para el papel originalmente pensado para divulgar el método OR (Mullis también era un coautor). Este papel de OR[2] así, se convirtió en la primera publicación de PCR, y durante varios años se convertiría en el informe más citado por otros investigadores.

Referencias

  1. ^ Saiki RK, Erlich, HA "Método para la detección de sitios de restricción polimórficos y secuencias de ácido nucleico". Los E.E.U.U. patente 4683194.
  2. ^ a b c Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Erlich HA; Arnheim N (20 de diciembre de 1985). "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de beta-globina y análisis del sitio de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes". Ciencia 230 (4732): 1350 – 4. doi:10.1126/Science.2999980. PMID2999980.
  3. ^ Saiki RK, Bugawan TL y Mullis KB, Erlich, "Análisis de la DNA beta-globin y HLA-DQa enzimático amplificada con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo" naturaleza vol. 324(6093) págs. 163-166 (1986).
  4. ^ Mullis K "El origen inusual de la reacción en cadena de polimerasa" Americano científico Vol. 262(4): págs. 56-65 (1990).
  5. ^ Mullis K "La reacción en cadena polimerasa", conferencia Nobel, 08 de diciembre de 1993.
  6. ^ Rabinow P "que hace PCR: una historia de la biotecnología" prensa de la Universidad de Chicago (1996).

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